原核表达实验.ppt

实验一:大肠杆菌表达载体的构建及融合蛋白诱导表达
生命科学技术学院
2010年6月
黑曲霉的优化培养
总DNA或RNA的抽提
PCR或RT-PCR扩增xynB基因
目的基因的TA克隆
质粒pMD-xylB
EcoRI+XhoI双酶切
凝胶回收试剂盒回收目的片断xynB
乙醇沉淀回收线性化片断
大肠杆菌表达载体pET-28(a)+
酶连
DH5
挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证)
28S
18S
BL21
挑取重组子, 用菌落PCR方法验证
IPTG诱导促使目的大量蛋白表达
细胞破碎及蛋白抽提
目标蛋白的纯化
蛋白质浓度测定--Bradford法
目标蛋白的鉴定—Western biotting
融合蛋白诱导表达流程图
XylB
CK
100mM IPTG
1ml LB+Kan
1-I
1+I
2+I
3+I
Ck+I
2-I
3-I
Ck-I
37℃, O/N
37 ℃,
37 ℃,
37 ℃, O/N
30 ℃, 4 h
28 ℃, 4 h
1ml LB+Kan
3ul
150ul
3ul
3ul
3ul
50ml LB+Kan
IPTG 100mM
Kan 100mg/ml 使用浓度50μg/ml
PBS缓冲液:
137mM NaCl
KCl
10mM Na2HPO4
10mM KH2PO4
试剂及缓冲液:
3×SDS缓冲液:
Tris-HCl (, 25 ℃)
6% w/v SDS
30% 甘油
% w/v 溴酚蓝
Gel Staining Buffer(每100ml):
考马斯亮蓝 250 mg
甲醇 45 ml
乙酸 10 ml
水 45 ml
Gel Destaining Buffer:
甲醇 100 ml
乙酸 100 ml
加水至 1000 ml
SDS-PAGE胶:
30%聚丙烯酰***
10% SDS
Tris-HCl
Tris-HCl
10% 过硫酸铵(现配)
TEMED
Tris-甘氨酸电泳缓冲液
25mmol/L Tris
250mmol/L 甘氨酸(电泳级)()
% SDS
可配成5×贮存液备用,,然后加入50ml 10%(w/v)的电泳级SDA贮存液,用去离子水补至1000ml。
操作步骤1: (小规模诱导-筛选正确表达克隆子)
1、从平板上挑取1个pET28-xylB/BL21转化子接种于装有2ml LB/Kan( Kan浓度50ug/ml)培养基的PA瓶中, 37oC, 250rpm,培养过夜;
2、取过夜培养物按1%接种量分别转接二个装有2ml LB/Kan的PA瓶中,37 ℃培养约2小时40分钟;
3、培养结束后,分别向其中一个瓶加入IPTG()并标记为“+I”,另一瓶不加IPTG标记为“-I”,28 ℃培养,250rpm,约4小时后收集菌体;
4、从“+I”、“-I”培养瓶中各吸取1ml菌液于两个标有“+I”、“-I”,离心收集菌体,10000 rpm、RT、1分钟,去上清,加入80ul缓冲液和40ul 3×SDS上样缓冲液悬浮菌体,-20℃保存备用。
5、取前面保存菌体(加入1×SDS上样缓冲液),置沸水5分钟(破细胞),然后置室温;
6、在室温以10000rpm离心1分钟,取上清10-20ulSDS-PAGE蛋白电泳检测。
附:SDS-PAGE胶的制备及蛋白质电泳: