青霉素G酰化酶工业进化的研究进展.pdf

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次已经可达肽;②208一AAa亚基;③54一AA内肽间隔物(spacer1000批甚至以上。合成反应侧链和母核比例也有peptide);(4)557一AAt3亚基“。信号肽负责将前体极大程度降低,阿莫西林甚至可以达到惊人的穿梭到膜周空间,:1(:1~:1),固定化后也可以PGA在细胞质中的积聚。在易位到周质后,信号肽达到800甚至以上的使用批次。成本已经压到了历被去除以形成proI,GA的另一种前体。随后,proP—史最低,整体技术达到瓶颈期,国内各个抗生素大厂GA开始自行折叠,同时自动催化去除周质中仅和G生产趋于平稳,技术改进动力较小。亚基之间的间隔Ⅸ。在周质区去掉连接肽,才能够组装成具有活性的PGA(图2)。根据物种来源不2PGA基因与结构同,亚基大小略有差异,PGA的d亚基一般为23--,决定底物专一性,B亚基一般为65~69不同物种来源PGA同源程度差异较大,例如:kDa,与PGA的催化水解性质有关:不同物种来源大肠杆菌,嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌的P(jA都为革兰的各个Ⅱ基大小不同、特性不同、T业进化上应用氏阴性菌,同源性高达87%。雷氏普罗威登斯菌,也不同。大肠杆菌,%~%,,而黄杆蔺(F/avoba{’triumsp.)650PGA与阻大芽胞杆菌pr卵GA吨丑矿哑口PGA同源程度仅为28%。不同来源的PGA具有不同的酶学参数,对相同底物具有不同的Km,对抑制剂的响应程度也不同。目前广泛使用的青霉素酰化一匝亏皿口酶主要来源于杆菌和巨大芽胞杆菌”,无色杆菌匝巫卜。/3,II;.I,t(Achromoha(,tersp.)CCM4824及其突变体等。其中,1960年就开始研究的大肠杆菌I,GA南丁表现ttj日来的高潜力(水解)、最适温度60℃以及同定后运行稳定性,80年代进入到作为F业催化剂尝试应用阶◇一◇+固段。因此,大肠杆菌PGA是研究最早、催化机理较图2前体PGA的加工为清楚的青霉素酰化酶。,早在1999年,在11105的天然产PGA大肠杆菌菌株中,发现3青霉素G酰化酶作用机理***(PAA)诱导其编码PGA的表达基因pa(’,而1995年,。已经确定。原晶体结构4,异二聚体的两条链紧密缠绕在一起:J3始PGA蛋白由a,,口哑Ⅱ基上N一末端的单一氨基酸Serl31为催化活性中基不具有酶活性,一级结构上一段间隔序列(spacer心,而不同于其他丝氨酸蛋白酶与邻近的His形成万方数据:..生物资源·425·电荷中继网,其最近的氨基为丝氨酸自身氨基。在年来PGA常用表达系统的评估。,由水分子参与、广义的酸碱催化机制。|3一亚基虽然已经有几种微生物宿主可用于异源PGA(Serl31)催化残基,被桥接水分子激活。如果脱水,的生产,但大肠杆菌无疑是最容易获得的宿主系统,PGA变得不活跃,因此,水必须存在。分析活性中基本上所有重组类PGA测定活力时首选表达体系心可以发现,a142M、a146F、f357F、f3154T、和13177I均为大肠杆菌,因为它具有强健的生长特性、对廉价位于疏水口袋的两侧部位。1367S位于疏水口袋底原料的高繁殖力、众所周知的生理和代谢以及基因部,整个疏水口袋由131S、13241N的侧链和1323、1369操作手段,周期短,表达量高。已有数十篇文章,涉的主链氮原子组成。这些信息为定点突变和计算机及多种手段(质粒构建、诱导表达、分子伴侣、培养条模拟的定向进化指明了方向。不同来源的青霉素G件优化等)报道如何提高PGA在大肠杆菌体系中的酰化酶的催化性质差别较大。运用动力学方法研究表达量【11。缺点为IPTG价格昂贵以及该体系非常了大肠杆菌,嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌,粪产碱菌来源容易形成包涵体。即便如此,目前以水解6一APA为的胞内青霉素G酰化酶的催化反应机制,也对有关主的PGA仍优先选择大肠杆菌来源PGA作为进化底物与酶的结合等步骤进行了研究n…。从机理上骨架,匹配选择大肠杆菌表达体系。讲,这种脱酰基过程类似于丝氨酸蛋白酶。,它对疏枯草芽胞杆菌是一种食品安全用菌株,有研究水基团高度特异,并使Serl31酰化,得到酰化酶中间报道巨大芽胞杆菌PGA在枯草杆菌中分泌表达时,体。反过来,这种复合物受到水分子(水解)或|3一内酶活力可达6U/mL【”]。2002年,利用重组枯草芽胞酰***核(合成)的攻击,它与氨基亚基(偏爱水性负电杆菌表达大肠杆菌PGA的绝对酶活力已经达到荷基团)相互作用,×104U/L[1“。后续有科学家报道,生物反应器素,最终被释放出来。PGA催化水解和合成的反应中枯草芽胞产生PGA可达51U/mL。由于研究人机理相同,但反应条件不同…。PGA介导青霉素G员选定的测定方法不同,活力也会有一定差异,不能在微碱性pH下水解生成6-APA和PAA,导致苯乙平行比较。此外,枯草芽胞杆菌表达体系现在未作为酰基部分从6一APA转移到水。Ser(t31)的羟基对酰PGA的工业生产体系来说,实际上这些表达水平现***键的羰基碳进行亲核攻击,从而通过四面体过渡在看来仍过低,现阶段仍不具备大规模工业化价值。态形成酰基一酶复合物的共价中间体。(13241)和Ala(1369)的另外两个氨基酸巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)利用甲醇作为的参与,第一种产物6-APA从活性位点释放。接下碳源,启动子为pAOXl,适用于高密度表达,可以稳来,酰基酶复合物通过水(或另一亲核试剂)的亲核定高产表达各种外源蛋白¨…。该系统载体选择多攻击脱酰基,产生第二种产物PAA和游离酶。鉴于样,可以实现胞内或者胞外分泌表达,并且可以体外所有步骤都是可逆的,在低水活性和酸性pH条件构建多个拷贝,或内部加压实现基因多拷贝存在。下,酰基与B一内酰***核的缩合成为可能,产生各种半2019年,利用巴斯德毕赤酵母重组表达来自大肠杆合成抗生素,这种催化的可逆性进一步巩固了PGA菌的Ec—PGA,并测定了细胞内外的产物浓度以及作为生产多种B一内酰***半合成抗生素的通用生物催基于流式细胞术的细胞活力,这些数据的提供使我化剂的重要性。们对重组巴斯德毕赤酵母种群在PGA工业化过程中产物分离与提取的了解更加深入¨…。毕赤酵母体4T业应用表达体系系在PGA水解方面也有一定应用,但需要构建多拷在过去的30年里,与PGA相关的菌株改造、生贝表达载体并与基因组重组,活力仍较低。因此,其物发酵等能力的提升,使得大规模生产PGA的技术应用不如大肠杆菌普遍并逐渐被淘汰。得到了蓬勃发展与应用。重组DNA技术已广泛应综上所述,大肠杆菌高表达系统通过引入外源用于细菌PGA的生化鉴定和大规模生产,其中大肠基因可以专门用于PGA的大规模生产,该方向主杆菌是其异源表达的主要宿主。由于下游加工在催要用于8一内酰***抗生素合成方向PGA的生产,水化剂制造成本中占了相当大的成本(40%~65%),解系统、主流表达系统为毕赤酵母系统和大肠杆菌研究人员花费了大量的努力优化PGA序列、表达体系统,合成方向表达体系以大肠杆菌表达系统为工系,提高工业用重组菌株的PGA产量,以下为近些、lk系统。万方数据:..·426·任丽梅等:青霉素G酰化酶工业进化的研究进展主流进化方向为合成,涉及的位点主要包括a142—5PGA工业评价标准与进化研究146,B24,p56,B177等核心位置。这些位置和前面基因定向进化方法有很多,例如定点突变,所述的核心区域重合或者在三级结构上较为临近。DNAshuffing等。2003年,利用DNAshuffing技术,水解研究主要以野生型研究以及Codexis公司2020在雷氏普罗威登斯菌PGA基因克隆和表达的基础年后释放的一系列专利为主。上,,最终合成活力提升40%¨7I。2022年,开从经济角度看,合成反应尽可能降低酰基供发胰蛋白酶消化与液相色谱一串联质谱(LC—MS/体/亲核试剂的摩尔比(S/H)是很重要的。然而,MS)联用的方法,通过蛋白质组学分析,鉴定了来自当接近反应物的化学计量比时,活化酰基供体的水八家公司的十二批PGA,并将其分为两类菌株(大解成为至关重要的参数。由于野生型PGA既具有M4824),在六批不同的SS一水解能力,也具有合成活力。因此,~,通常要测定两个指标:即最适条件下白,远低于DSM报告的35ppm的安全限值[1…。一的合成能力(S)以及最适条件下的水解能力(H),般而言,PGA的进化是集中在为了更好地合成反应并且通过评定S/H比值变化来评判PGA的合成水指标做准备,而水解仅应用不同来源野生型序列就解倾向。笔者以下叙述目前工业界广泛应用的不可以达到目的。近15年来,代表性的各个物种进化同方向PGA进化时使用的几个主要骨架来源与突方式、突变点的专利参见表2[19~3“。我们可以看到,变点积累情况。表2近15年代表性PGA进化情况统计Table2StatisticsofrepresentatiVePGAevolutioninrecent15years序号分类物种来源筛选出的关键位置/突变位点效果文献A’~’…。’…’·定塞突。西c…herichia菌c础∥a3域,a77。4,8篙90,a14意4,a192变,132,Ⅲ4,8m109’辫13148,Val92E,FB24,V。148L,F。t460L鬃淼,蒜…‰组合定突巨大芽胞杆菌2Yal44R或V1324F或两者组合彗耋擘竺黧?了全的s7H比是野生[20]。(Bacillusmegaterium)型的3倍,(Escherichiacoli)Ft324A,Fal46位置相关誊苞苎点西:611寞璧时侧链立体选择[21]一。性,提升S/H近4倍无色杆菌含有以下6个突变位点的突变体:Na提升阿莫西林、头孢克洛、头孢氨苄定突4(Achromobactersp.)184Y,F824A,L13248A,D13417N,LB合成活力,降低侧链母核比例,提升[22]点变CCM4824564F,Gt3584AS/Hs飘西c…herichia菌c础,嚣黧麓溉||蒜罐婴孙5/ri,N13241Q,Mal62L,FJ324G,F8romobacter。麦署芝。Mr艴omob釉acter。p.)………………。71Y,A。乏篇裟嚣慧,S徘/H:t曾虾JJff瞰,6磁㈨^ccM48。4跟㈡ov,举4……合。。缫,篡纛瑟孺一无色杆菌提高多种抗生素的高效合成,提升s/,定妻突(Achromobactersp.,嚣警嚣嚣嚣嘉蓄茹≯昌篙薯菝鬻;慧掣羧∥陟,CCM4824CA,7一APRA靴鞑N99%万方数据:..生物资源·427·注:具体突变位置有的是按照亚基编号,有的是全序列编号,取决于引用专利或文章的撰写****惯;关于突变点总体分析说明可以参见参考文献正文Note:ordingtosubunitsorfullsequencenumbers,,,2000年,将B亚基427组应用,并保护其在阿莫西林、头孢羟氨苄、氨苄西位(突变A)和430位(突变B)赖氨酸残基突变为丙林、头孢氨苄合成中,中间体6一APA,7-ACA制备领氨酸,降低了该酶的等电点,增加了疏水性,从而提域的应用旧8’圳。2021年,将Ax—PGA不同亚基的突高其在酸性和有机溶剂环境中的稳定性,最高可提变位点(GF24、aRl41和aFl42)整合到一起,得到三高166%¨“。2018年,通过蛋白质工程提高了PGA重突变体aRl41A/aFl421/13F24G,其在工业生产中的立体选择性。与野生型酶相比,含有FIa24A的突表现出更好的性能,活化酰基供体(R)一扁桃酸甲酯变体对(R)一PGME具有98%以上的立体选择性。改进后的酶可用于氨苄西林的合成心“,更多内容参的(kcat/Km)¨…。值得一提的见表2。是,无色杆菌PGA热稳定性更好、,其在氨苄西林和阿莫西林合成中具有更高的2007年,申请PCT专利,公开并保护全长为2效率(较高的S/H比和产品积累)。万方数据:..·428·任丽梅等:,成本控制会更加严格。另外,有关巨大芽胞杆菌PGA以及其他物种PGA也结合PGA在非抗生素领域的功能的需求可能进一曾在一段时间为研究热点,具体突变手段、位点参见步拓宽,例如精细化工及医药中间体的手性拆分、特表2。总体来说,随着时间进展,其他这些物种来源定结构化合物化学修饰后的特异性水解、多肽合成的PGA进化已经被无色菌属菌株骨架所替代。水解等,这就对PGA的分子功能的精细化定向进化提出了更高、更细致的要求。所以,结合抗生素生6结论与展望产、各种中间体的制备、手性药物的拆分等方面多种拥有百年发展史的B一内酰***类抗生素对人类健因素考虑,未来PGA的发展机遇与挑战并存。康、社会发展起着举足轻重的促进作用。与此同时,自然界中微生物的耐药性不断增加,推动了天然来参考文献源青霉素类、头孢菌素药物类到半合成|3一内酰***抗[1]SriranganK,OrrV,AkawiI。,。对口一内酰***半合成抗生素的高需advancesonpenicillinGacylase:pharmaceuticalimplica—求,将继续推动PGA