体外受精囊胚培养液中mtDNA拷贝数与囊胚发育潜能的相关性研究.pdf

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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。:..·202·生殖医学杂志2023年2月第32卷第2期DOI:.1004—¨,徐楗荧1,阮永铭1,曾伟荣1,赵琴1,许伟标1,吴松2(1_珠海市妇幼保健院,珠海519000;,苏州215000)【摘要】目的探讨第5/6天发育囊胚(D5/D6囊胚)培养液中线粒体DNA(mtDNA)拷贝数与胚胎质量的关系。方法收集2021年7—12月在珠海市妇幼保健院生殖中心行胚胎植入前遗传学检测(PGT)的10名患者的36枚D5/D6囊胚的活检细胞和培养液样本,应用高通量测序(NGs)方法检测分析囊胚活检细胞的非整倍体性和培养液中mtDNA拷贝数。根据囊胚形态学评价分为高质量、一般质量、低质量囊胚3组,根据囊胚发育时间分为D5和D6囊胚组,根据染色体整倍体性分为整倍体和非整倍体囊胚组,比较各组间囊胚培养液中mtDNA拷贝数的差异。结果36枚囊胚中D5囊胚33枚(D5囊胚组)、D6囊胚3枚(D6囊胚组);高质量囊胚21枚(高质量囊胚组)、一般质量囊胚12枚(一般质量囊胚组)、低质量囊胚3枚(低质量囊胚组);整倍体囊胚19枚(整倍体囊胚组),非整倍体囊胚17枚(非整倍体囊胚组)。高质量囊胚组培养液中mtDNA拷贝数[(±)]略高于一般质量囊胚组[(±)]和低质量囊胚组[(±)],但差异无统计学意义(P>)。D5囊胚组培养液中mtDNA拷贝数[(±)]略高于D6囊胚组[(±)],但差异无统计学意义(P>)。整倍体囊胚组培养液中mtDNA拷贝数[(±)]略高于非整倍体囊胚组[(±)],差异亦无统计学意义(P>)。结论不同形态学评级、囊胚发育时间和染色体整倍体性囊胚培养液中mtDNA拷贝数无显著差异,胚胎质量与培养液中mtDNA拷贝数的关系有待进一步确认。【关键词】囊胚培养液;胚胎质量;mtDNA;高通量测序【中图分类号】【文献标识码】ACorrelationbetweenmtDNAcopynumberinblastocystculturemediumandblastocystdevelopmentpotentialCAjG“i一扣以gh,XU.,如卵一y锄91,RL礁Ny0行g-mi聍91,ZENGW踣r0竹91,ZHA0Q门1,XUW≥,￡Pr,Z矗“^以iM口￡Pr以口Z&C^iZdHP口Zf矗Hospif口Z,Z^“。卵Gg咒07咒icsC07”夕n押y,L￡d.,S“z^o“215000【Abstract】objective:ToinvestigatethecorrelationbetweenthequalityofDay5/6blastocystandthecopynumberofmitochondrialDNA(mtDNA):Thirty—sixDay5/6blastocystbiopsycellsandculturemediumsampleswerecollectedfrom10patientswhowereunderwentIVF——generationsequencing(NGS).Accordingtoblastocystmorphologicalevaluation,theblastocystsweredividedintothreegroups:high,ordinary,and10w—,blastocystsweredividedintoDay5and【收稿日期】2022一08—24;【修回日期】2022一11一07【基金项目】珠海市科技计划医疗卫生项目(重大项目)(20191207F060002)【作者简介】蔡桂丰,男。广东潮州人,本科,主任技师,医学检验专业.(。通讯作者)万方数据:..生殖医学杂志2023年2月第32卷第2期·203·,:Ofthe36blastocysts,33wereDay5blastocysts(Day5blastocystgroup)and3wereDay6blastocysts(Day6blastocystgroup);21high—qualityblastocysts(high—qualityblastocystsgroup),12ordinaryqualityblastocysts(ordinaryqualityblastocystsgroup)and310w—qualityblastocysts(10w—qualityblastocystsgroup).ThemtDNAcopynumberofblastocystculturemediuminthehigh—qualityblastocystgroup[(±)]werehigherthanthoseintheordinaryqualityblastocystgroup[(±)]andthe10w—qualityblastocystgroup[(±)],butthedifferencewasnotsignificant(P>).ThemtDNAcopynumberinDay5blastocystculturemedium[(±)]werehigherthanthatinDay6blastocystsgroup[(±)],butthedifferencewasnotsignificant(P>).ThemtDNAcopynumberinculturemediumofeuploidblastocystgroup[(±)]werehigherthanthatintheaneuploidblastocystgroup[(±)],butthedifferencewasnotsignificant(P>).Conclusions:ThereisnosignificantdifferenceinmtDNAcopynumberamongtheblastocystculturemediawithdifferentmorphologicalgrades,:Blastocystculturemedium;Embryoquality;MitochondrialDNA;Next—generationsequencing(JRP口rodMPd2023。32(02):202—207)线粒体是人体细胞内细胞器之一,在线粒体不精确和高度主观的形态学和形态计量分级系统。DNA(mtDNA)和核DNA驱动下它们负责细胞能重要的是,即使在植入前遗传学检测(PGT)筛选到染量物质ATP生产,因此也被称为细胞的能量工厂,色体正常胚胎的情况下,仍然有部分移植胚胎无法植同时也参与介导细胞的增殖、凋亡和分化。线粒体入或活产口叩;同时,PGT作为一种有创性的胚胎选择自身拥有一套独立的基因组DNA,其拷贝数量取决技术对于胚胎的影响也存在争议。2014年Stigliani于细胞内线粒体的数量。在成熟的人类精子中,大等[1u发现,99%以上的废弃胚胎培养液样本可以检约有22~75个这样的细胞器被包裹在中段周围,而测到mtDNA,证明培养液中含有mtDNA是一种常大量的线粒体分布在卵母细胞的细胞质中[1]。受精见现象,且与核DNA相比含量更高。近年来相关学后,主要遗传自母系卵母细胞的线粒体会发生不对者通过这种无创的方式探究了培养液中mtDNA与称分离,有研究表明线粒体在发育中胚胎形成的卵胚胎发育潜能的关系[11‘14],但研究数量有限,胚胎培裂球中分布不均衡,直到囊胚阶段才自主复制[1。4]。养液中mtDNA与胚胎质量的关系有待进一步确认。在人类生殖过程中,生殖细胞的形成和受精、着床前本研究选择了第5或6天发育囊胚(D5或D6囊胚)胚胎的发育及胚胎着床都需要大量的细胞能量供培养液,应用高通量测序(NGS)技术检测培养液中给[5书],线粒体对于成功受精和正确的胚胎植入和发mtDNA拷贝数,试图了解mtDNA拷贝数与常规胚育至关重要,ATP含量不足与受精失败和胚胎发育胎形态、非整倍体性和囊胚发育时间的关系,为新的异常有关卧一]。因此,卵母细胞中线粒体的质量决囊胚质量评价指标提供数据支持。定了卵母细胞的质量,进而决定了发育中胚胎的资料和方法质量‘8|。在辅助生殖技术(ART)应用中,胚胎质量是影响一、研究对象辅助生殖治疗的一个关键因素[9]。尽管ART取得了选取2021年712月于珠海市妇幼保健院生实质性进展,但评估胚胎生存能力的临床工具几乎没殖中心就诊的10名行PGT的患者为研究对象。10有发展,胚胎学家在选择最佳移植胚胎时仍然依赖于名患者获得正常受精并培养发育至4期的36枚囊万方数据:..生殖医学杂志2023年2月第32卷第2期胚,采集囊胚活检细胞和培养液。式进行量化,即平均每核基因组下mtDNA的拷贝10对夫妇均签署了卵胞浆内单精子注射(ICSI)数。把比对到线粒体基因组的测序读取序列进行计和PGT知情同意书。医院生殖伦理委员会对此研数,并通过比对到常染色体的读取序列计数进行均究项目通过伦理审查。一化;根据以下公式计算和显示每个核基因组的二、研究方法mtDNA拷贝数:mtDNA拷贝数一(:将成熟卵母细胞进行ICSI后转区域数×2×比对线粒体读取序列数量)/(比对常染移至G一1PI。US培养液(Vitr01ife,瑞典),16~18h色体读取序列数×比对线粒体区域数)。后观察双原核(2PN)形成情况。第3天(D3)根据三、统计学分析胚胎质量评分,用合适的剥卵针进一步去除D3胚采用GgstatsplotR语言程序()进胎的颗粒细胞,每个胚胎清洗3次后转入G一2行统计分析和作图。mtDNA拷贝数以(孑±5)表PLUS培养液(Vitrolife,瑞典)中培养到D4,再转入示,组间比较采用独立样本方差分析和Welch￡检单微滴进行培养,每个培养滴25肚l,培养至D5进行验。以P<。观察并评分。:采用Garnder囊胚评分法[15]对培养的囊胚进行形态学评估,参考Klimczak一、样本分组囊胚分类标准口63对囊胚分组:(1)高质量囊胚,包括本次研究共收集到36枚囊胚,其中D5囊胚3~6AA和4~6AB囊胚;(2)一般质量囊胚,包括33枚、D6囊胚3枚。根据形态学评估结果,高质BB、1~3AB及1~2AA囊胚;(3)低质量囊胚,包括量囊胚21枚、一般质量囊胚12枚、低质量囊胚3枚。根据胚胎植入前非整倍体遗传学检测(PGT-A)AC、CA、BC、囊胚。结果,整倍体囊胚19枚,:当囊胚发育到4(表1)。期(一般为D5/D6),评估胚胎等级,选择4CB/4BC二、不同形态学质量评价囊胚培养液中mtD—以上囊胚进行活检。用记号笔在样本采集管上标NA拷贝数比较号,用移液器在需采样的培养液中反复吹吸3次后根据发育囊胚形态学质量评价分组,检测结果收集胚胎培养液样本(避免吸到油滴),收集1个培显示质量评价为高质量、一般质量和低质量胚胎组养滴更换1次枪头,避免交叉污染。将样本采集管置的mtDNA拷贝数分别为[(±),九一于迷你离心机(珠海黑马)上,瞬时离心(4000r/min,21]、[(±),托一12]和[(±5~10s),确保采集的样本置于采集管底,一80℃),行一3],组间差异元统计学意义(P>)保存。(图1)。(WGA)和NGS分析:三、D5和D6囊胚培养液中mtDNA拷贝数对收集的囊胚活检细胞和培养液进行wGA,然后比较通过ChromInst(EKl00100724NICSInstTM文库制备根据囊胚发育时间分组,检测结果显示D5和D6试剂盒;苏州亿康基因)进行文库制备。使用Qubit@囊胚培养液中mtDNA拷贝数分别为[(±dsDNAHSAssayKit(货号Q32851;Invitrogen,),艴一33]和[(71100±),姐一3],组间国)对扩增建库产物进行纯化和定量,然后使用差异无统计学意义(P>)(图2)。IlluminaNextSeq550平台(Illumina,美国)进行双四、整倍体和非整倍体囊胚培养液中mtDNA端reads75测序,每个样品产生大约150万个测序拷贝数比较读数。下机数据进行引物接头和低质量序列的过根据囊胚活检细胞整倍体性分组,检测结果显滤,过滤后的高质量reads序列比对到h919人类参示36份囊胚活检细胞中整倍体囊胚和非整倍体囊考基因组,并进行重复reads序列去除和碱基GC胚分别为19枚和17枚,其中整倍体组和非整倍体含量校正,剩余唯一比对reads使用CBS分割算法组培养液中mtDNA拷贝数分别为[(±V)分析。)]和[(±)],组问差异无统计mtDNA含量以mtDNA拷贝数/核基因组的形学意义(P>)(图3)。万方数据:..生殖医学杂志2023年2月第32卷第2期表l囊胚评价指标情况表辐匡嫩《Zo吕高质警囊胚‘般质量囊胍低质量囊胚图1不同形态学质量评价囊胚组培养液中mtDNA拷贝数比较鼎匡迎《ZoED5瞧胚D6囊胚图2D5和D6囊胚培养液中mtDNA拷贝数比较整f齐体囊jj}l!卅整倍体囊胚图3整倍体和非整倍体囊胚培养液中mtDNA拷贝数比较讨论优质胚胎的选择是生殖医学技术发展所关注的一个重点问题。虽然现阶段基于胚胎形态学和遗传学的评估已经在辅助生殖临床治疗应用上取得了良好效果,但这些方法仍然存在着一定的局限性,如形态学评估的主观判断差异、胚胎活检细胞遗传学检测的有创性。近年来,胚胎培养液或腔液中遗传物质的发现引起了学者的关注,已有数据表明包括培养液中细胞核DNA和mtDNA可以被成功分离、检测和分析r17_21],这为胚胎遗传学的无创评估提供万方数据:..生殖医学杂志2023年2月第32卷第2期了基础。目前,针对核DNA的无创评估已经取得来源不明、DNA产量和完整性较低、潜在外源性污了一定的进展,但是对于囊胚培养液中mtDNA的染、培养液或囊腔液样本采集标准不统一、数据处理无创评估研究较少。本研究通过NGS无创检测囊和分析不一致等问题对培养液中遗传信息的无创研胚培养液中mtDNA拷贝数,探究mtDNA拷贝数究带来了挑战瞳1。22I,这也可能是影响目前研究结果与胚胎质量的关系。差异的重要原因。一般而言,在当前胚胎评价中形态学质量评分但本研究仍存在一些不足之处:首先,研究纳入高和整倍体的囊胚具有更好的胚胎质量或发育潜的胚胎样本数量较少,导致最后分组间差异较大;其能。本研究尝试探索不同形态学质量评级、不同整次,未纳入胚胎移植及妊娠结局的相关数据,导致研倍体性和不同发育时间(D5/D6)的囊胚培养液中究结论有一定的局限性。后续应完善实验设计,开mtDNA拷贝数的差异,研究结果与先前的一些研展更大样本量的队列研究加以分析。究有所不同。在Stigliani等[11。121的两项研究中,其综上所述,不同形态学评级、囊胚发育时间和染中一项研究比较了A等级与B、C等级D2/D3胚胎色体整倍体性囊胚培养液中mtDNA拷贝数无显著培养液中mtDNA/核DNA比值,结果显示两者无差异,胚胎质量与培养液中mtDNA拷贝数的关系明显差异[123;另一项研究结果显示,可以形成囊胚有待进一步确认。在当前囊胚培养液mtDNA拷贝的D3卵裂胚培养液中mtDNA/核DNA比值显著研究数据较少的情况下,本研究为进一步探究囊胚高于不能成囊的胚胎,且可在D5发育至3或4期培养液中mtDNA拷贝数与胚胎质量关系提供了参囊胚的D3卵裂胚培养液中mtDNA/核DNA比值考数据。显著高于发育较慢的胚胎,表明高mtDNA/核【参考文献】DNA比值是高发育潜能胚胎的一个参考指标[11I。李亨利等¨朝对卵裂期胚胎培养液中mtDNA拷贝[1][J].BiochimBiophysActa,数在不同胚胎形态学质量分组中进行了比较,研究2014,1840:,形态学优质组(以卵裂球数目判定)显著[2]VanBlerkomJ,DavisP,)ifferentialmitochondrial高于非优质组,发育正常速度组显著高于异常速度distributioninhumanpronudearembryos1eadstodisproportionate组,而高评分组与低评分组无显著差异。本研究中,inhe“tancebetweenblastomeres:Relationshiptomicrotubular在高质量、一般质量、低质量囊胚以及D5、anization,petence[J].HumR印rod,分组中并未发现培养液中mtDNA拷贝数的显著差2000,15:262卜2633.[3]PodolakA,I。issJ,KiewiszJ,。分析其原因可能因为,不同时期胚胎样本、胚胎numberincleavagestagehumanembryos—Impactoninfertility形态学评价的标准、mtDNA检测方法和量化方法IssuesMole[J].currBiol,2022,44:273—。[4]May-PanloupP,M,ElHachemH,etal_EmbryoZhang等[14]进一步对囊胚培养液中mtDNA进anditsmitochondria[J].Antioxidants(Basel),2021,10:,多重因素线性回归分析显示,培养液中[5]stJohnJc,Facucho一0liveiraJ,JiangY,“a1mtDNA拷贝数与囊胚活检细胞mtDNA拷贝数DNAtransmission,replicationandinhe“tance:Ajourneyfromthegametethroughtheembryoandintooffspringand(P—)、女性年龄(P—)、囊胚评分(P—embryonicstemcells[J].HumReprodupdate,:488—)呈显著正相关,(P—),说明囊胚活检细胞mtDNA[6]。、女性年龄、囊胚评分可能是影响培养液中mitochond“alrespiratorychain:AnewchallengeforthemtDNA拷贝数的因素。本研究未进行线性相关性mechanismandcontrolofo“dativephosphorylation[J].AdvExpMedBi01,2012,748:107—,但从不同分组问平均mtDNA拷贝数的数据[7],从低质量到高质量囊胚呈现上升趋势,但viableblastocyst[J].()bstetGynec01Int,2013,2013:尚无统计学差异,[8]vanderReestJ,hinoG,HaigisMc,。同时也有研究提出,目前囊胚培养液中DNAIⅥitochond“a:theirrelevancedu“ngoocyteageing[J].万方数据:..生殖医学杂志2023年2月第32卷第2期·207·AgeingResRev,2021,70:87—“alDNA:relationshiptoembryoqualityand[9]PaulsonRJ,SauerMV,I,[J].,2018,35:implantationafterhumaninvitrofertilization:ahypothesis871—877.[J].AmJ()bstetGynecol,1990,163:]PaliniS,GalluzziL,DeStefaniS,[10]hinoGN,Garcia—[J/0L].ReprodBiomed()nline,numberasapredictorofembryoviability[J].Fertilsteril,2013,26:603—,111:205—211.[18]GianarollL,MagliMc,PomanteA,:a[11]StiglianiS,PersicoI。,LagazioC,etal,Mitochond“,non—invasivefromapilotstudy[J].Fertilsteril,2014,102:1692—[19],RossR,etal-Blastocoelfluidfrom[J].MolHumReprod,2014,20:1238—“al[12]StiglianiS,AnseriniP,Ventu“niPL,—genomedeoxyribonucleicacidamplificationprehensivechromosomemicroarrayanalysis[J].associatedwithhumanembryofragmentation[J].,2015,104:418—,2013,28:2652—2660.[20]Ma91lMC,PomanteA,CafueriG,[13]李亨利,田东梅,侯建文,:polarbodies,blastomeres,trophectoderm数与胚胎质量关系的研究[J].发育医学电子杂志,202l,9:cells,orblastocoelicfluid?[J].FertilSteril,2016,105:—683.[14]ZhangJ,XiaH,ChenH,-invasivechromosome[21]HammondER,shellingAN,[J].JAssistmedium:evidenceandpotentialclinicaluse[J].HumReprod,,2019,36:2505—,31:1653—1661.[15]GardnerDK,l。aneM,StevensJ,[22]高明,[J].e:towardsasingle中国科学(生命科学),2020,50:616—[J].FertilSte“l,2000,73:1155—1158.[16]KlimczakAM,PachecoI。E,I,ewisKE,[编辑:罗宏志]万方数据