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金抗肽SIF4对大肠杆菌基于细胞壁靶点的非细胞质膜损伤抑菌机理.pdf


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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。:..金抗肽SIF4对大肠杆菌基于细胞壁靶点的非细胞质膜损伤抑菌机理李玉珍1,肖怀秋轧2,刘淼1,王琳1,曾梦琪1,赵谋明2(,湖南株洲412000;,广东广州510641)摘要:为阐明金抗肽SIF。对食源性大肠杆菌基于细胞壁靶点的非细胞质膜损伤抑菌机理,研究了SIF4对细胞壁损伤的影响、与细胞壁脂多糖竞争性结合机理及对细胞壁膜组分影响机理,并运用扫描电镜分析了菌体形貌变化。研究发现,SIF。对菌体细胞壁有破坏作用,在一定浓度范围内。细胞壁受损与SIF4处理时间和处理剂量呈正相关,且组间差异显著(P<);SIF4可与细胞壁脂多糖(LPS)竞争性结合,结合量为256mg/L或更大时,表现无抑菌活性;傅里叶变换红外光谱(FT—IR)分析发现,SIF4对细胞壁多糖信息区、蛋白质与脂肪酸混合信息区影响明显,揭示细胞壁是潜在抑菌效应靶点;扫描电镜(SEM)分析发现,SIF。可破坏菌体细胞壁膜结构并改变菌体形貌。研究认为,SIF4可基于细胞壁损伤靶点作用于大肠杆菌并实现高效抑菌活性,研究结果可为阐明基于细胞壁靶点的非细胞质膜损伤抑菌机理和食源性大肠杆菌生物防控提供依据。关键词:金抗肽;细胞壁;大肠杆菌;非细胞质膜损伤;抑茵机理中图分类号::1673—1689{2023)06—0078-06DOI:.1673—-CytoplasmicMembraneDamageAntimicrobialMechanismofMetalAntimicrobialPeptideSXF4AgainstEscherichiacoliBasedonCellWallTargetLIYuzhenl,XIA0Huaiqiu+地,LIUMia01,WANGLinl,ZENGMengqil,ZHA0Moumin92(,HunanChemicalVocationalTechnologyCollege,Zhuzhou412000,China;,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510641,China)Abstract:Toelucidatethenon—cytoplasmicmembranedamageantimicrobialmechanismofmetalantimicrobialpeptideSIF4againstfoodbomeEscherichiacoli()basedoncellwalltarget,theeffectofSIF。(LPS),ponentswereinvestigated,。:2022—08一11基金项目:湖南省自然科学基金科教联合基金项目(2022JJ60046,2021JJ600040)。作者简介:李玉珍(1981--),,副教授,主要从事食源性致病微生物生物控制的研究。E-mail:******@:肖怀秋(1981一),男,硕士,教授,主要从事食品抗菌与保鲜研究。E-mail:******@:..李玉珍,等:金抗肽SIF。对大肠杆菌基于细胞壁靶点的非细胞质膜损伤抑菌机理treatmentdoseofSIF4,andthedifferencebetweengroupswassignificant(P<).S1F4couldharides(LPS),however,(FT—IR)harideinformationarea,aswellasthemixedinformationareaofproteinandfattyacid,(SEM)-:metalantimicrobialpeptide,cellwall,Escherichiacoli,non·cytoplasmicmembranedamage,antimicrobialmechanism食品富含碳水化合物、蛋白质和脂肪等营养组伤角度研究了金属抗菌肽(简称金抗肽)SIF。对大肠分,在其加工链各节点均极易受到食源性致病菌污杆菌抑菌机制发现,SIF。可破坏细胞质膜结构、增强染,既影响营养价值,还可产生潜在生物***。食源细胞质膜通透性、诱导膜去极化和膜氧化损伤,导性致病菌(foodbornepathogen)以大肠菌群污染和大致胞内物质泄漏并造成细胞聚沉,并对大肠杆菌细肠杆菌超标为主,是引起食品公共安全事故与食物胞壁有破坏作用【12-”。吴萱等从北京6个辖区的大质膜抑菌机理还不清楚。因此,,%,对甲氧苄氨嘧啶一磺***甲从细胞壁损伤靶点研究了SIF。对大肠杆菌的非细恶唑高度耐药,其次为多西环素【2】;张耀文等采用大胞质膜损伤机理,以期为食源性大肠杆菌生物防肠杆菌荧光PCR试剂盒对采集的90份生鲜驼乳进控提供理论依据。行致病性大肠杆菌检测发现,大肠杆菌检出率为20%t31:刘文双等分析山东不同地区蛋鸡养殖场分离的440株大肠杆菌6f咖州基因流行情况及耐药性,%菌株携带6fn倒埘基冈,携带6fom埘基因菌金抗肽SIF。:作者所在课题组自制m1;大肠杆菌株阿莫西林耐药率最高,四环素耐药率次之f41。25922:上海保藏生物技术中心获得:牛肉膏、抗菌肽具有抗菌谱广、稳定性好、特异性强、对蛋白胨、NaCl、曲拉通(Triton—X100):圉药集团;细哺乳动物细胞毒副作用少且不易产生耐药性等优胞壁脂多糖:北京索莱宝科技有限公司:多黏菌素势,可多靶点作用于食源性致病菌,是最具潜力的B:南京都莱生物技术有限公司:其他试剂:国产分抗生素替代品,特别适用于多重耐药性食源性致病析纯。菌抑制酗}。。Alamethicin通过d一螺旋JEM一7500F型扫描电子显微镜:日本株式会肽结构以“俑板模型”增强细胞质膜通透性并抑制社:UV一2600紫外ir见分光光度计、IRPrestige一21菌体增殖171,CecropinA以“毯式模型”靶向作用于细傅里叶变换红外光谱仪:日本岛津公司。胞质膜脂质双分子层181。大量研究H1】认为,『141并修机理,但有部分抗菌肽在细胞膜表面形成跨膜孔道改。,、120r/min培养l2h,4000r/min菌体死亡,也就说抗菌肽存在其他非细胞质膜损伤离心10rain,收集菌体?用PBS溶液(,效应靶点㈣。)稀释至OD6∞。、~—■————■圈圈—瞄■_圈暖圈瞄鞠麓豳蠢—■■■翻豳豳潮嚣圈圈蹬醴豳豳瞄赣鞫霞黯礴嬲麟台晶5-t物披木学报2023年第42卷第6期_圜鞠圜隧鬻豳—■万方数据:..LIYuzhen,etal:Non-CytoplasmicMembraneDamageAntimicrobialMechanismofMetalAntimicrobialPeptideSIF4AgainstEscherichiacoliBasedonCellWallTarget养板中每组每孔先加入100斗L菌液并分为3组:A差异法,非齐性时使用塔姆黑尼T2方法。组每孔加入50“LPBS缓冲液(阴性对照);B组每孔加入50“LTritonX一100(质量浓度为300mg/L,阳性对照);C组每孔加入50¨LSIF。,、MIC和2MIC(MIC=),振荡均细胞壁在菌体保护、形态维持、细胞增殖和信匀后于37℃,一旦受损,对细胞形态A630。o与胞内生物分子功能有重要影响【18】。SIF。。25922为供试菌株,参考刘天琪旧等方法并修改。将SIF4与脂多糖(LPS)预先孵育后再测定细胞存活率以验证SIF4与细胞壁脂多糖竞争性结合机制。用无菌PBS溶液配制SIF。溶液并与质量浓度为1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1mg/L的大肠杆菌细胞壁脂多糖等体积混合(终质量浓度为lMIC).37℃共育60rain:将共育物与等体积大肠杆菌(1x106CFU/mL)于37℃温育2h;,37℃培养24h。计数菌落斑数并计算细胞存活率。以多黏菌素B(终质量浓度为1g/L)作为阳性对照。(P>),不同字母表示差异显著方法并修改[161。将对数生长期菌体于4000r/min离(尸<)。心10rain,(OD630。~)。℃温育2h(终质量浓度为1MIC),由图1可看出,对照组A积。。表明菌体生长没有受到影响:。处理30min时,试验组组间差异不显著(P>),但与对照组差异显著(P<);处理60、90、律,解析SIF4处理对菌体细胞壁组分的影响机制。120min时,组间差异显著(P<),,A啪。值呈显著下降趋势(尸<等方法并修改㈣。取对数期菌体于4000r/)。表明菌体细胞壁受到不同程度损伤,使细胞10min,收集沉淀,用PBS溶液洗涤数次并重悬;将壁通透性增加,与抗菌肽MDpep9对大肠杆菌细胞菌悬液与SIF4等体积混合(终质量浓度为1/2MIC、壁影响相似【14】。TritonX一100可破坏菌体细胞壁,导1MIC和2MIC),37℃温育2h,4000r/,加入戊二醛(%)固定过夜,用和影响胞内物质生物合成,TritonX一100可能以“毯PBS洗2遍,再用乙醇梯度洗脱(体积分数为30%、式模型”介入细胞膜并进入胞内,SIF。对大肠杆菌作50%、70%、85%、90%各1次,体积分数100%2次)用机制类似TritonX一100,但显著低于其对菌体细胞10min,滴于洁净盖玻片烘干,将盖玻片粘在样品台壁的破坏作用(P<)。抗菌肽主要通过抑制细胞上并经离子溅射喷金和扫描电镜观察菌体表面形壁合成和(或),对照组为PBS组。,破坏细胞正常形态而最终导致细菌死x+,从而阻碍菌体正常生长[20l,而家蝇抗万方数据:..李玉珍,等:金抗肽SIF。对大肠杆菌基于细胞壁靶点的非细胞质膜损伤抑菌机理菌肽则可破坏大肠杆菌细胞壁结构完整性【14】。SIF4通过静电吸附作用发挥抗菌活性,也有可能是SIF。对细胞壁的破坏作用可能是因为金抗肽SIF4为金结构中的Fe“可取代Zn“、M92+等维持脂多糖结构稳属阳离子抗菌肽,可与细胞壁负电性脂多糖竞争性定的金属离子,从而发挥良好抑菌活性㈤。[12,211。傅里叶变换红外光谱(FT—IR)(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁外壁的一用于微生物细胞与微生物组分的鉴别[16t261。SIF4处理层较厚的类脂多糖类物质,是抗菌肽主要的非细胞前后菌体细胞壁膜红外光谱见图2。质膜效应靶点122]。SIF4与细胞壁脂多糖竞争性结合试验结果见表1。表1SⅢ。与脂多糖竞争性结合试验结果‘Fable1Cmnpetitivebindingresultsbct、、CellSIi?。,|I∥■掣蕾、、≯。1’。一!‘j~:::~。、。1Ig/l。±“21rag/1。H’±。lJ’±“44mg/±…1‘58mg/±‘616Ing压。±“±‘,LPSI;Yr—IR提供的分子特征基团吸收谱带可用于描864mg/l,±‘述细胞壁膜组分信息,其中,900。500cm。1为指纹信9128mg/±;1200—900am一为细胞壁多糖信息区;1500。10256n1∥±“1200am一为蛋白质和脂肪酸混合信息区域:11512mg/。±’。l800~1500am。1为多肽酰***和蛋白质信息区:121024mg/±“3000~2800am一为脂肪酸信息区[261。当抗菌肽结合注:相同字母表示组间差异不显著(P>),不同字母表示菌体细胞壁并破坏细胞壁膜结构时,可引起红外光组间差异显著(P<)。谱图谱特征区吸收光谱的改变。由图2可看出,与由表1可看出,随着LPS质量浓度升高,SIF。对照组相比,试验组(1MIC组)在1200~900、抑菌活性降低(细胞存活率上升),说明SIF4可与l500—1200、3000~2800am。1的3个区间红外光LPS有效结合并影响抑菌活性。SIF4与LPS结合效谱吸收峰变化明显,分别对应细胞壁多糖信息区、率越高,游离SIF4越少,抑菌效率就越低,否则抑菌蛋白质与脂肪酸混合信息区、脂肪酸信息区,表明效率就越高㈤。在LPS质量浓度为256mg/L时,细SIF4对细胞壁多糖信息区、蛋白质与脂肪酸混合信胞存活率为(±)%,SIF4不再具备抗菌活息区以及脂肪酸信息区域有一定影响,特别是1200~性,表明SIF4和LPS最大结合量可达到256mg/L,900am。1和1500—1200cm一区域影响最明显。揭研究结论与抗菌肽APl6一A类似㈣。研究还发现,示细胞壁是金抗肽SIF4的潜在抑菌效应靶点【12_埘。SIF4在质量浓度1—4mg/(P>),多黏菌素B可与扫描电镜(SEM)是观察微生物菌体形貌最有效细菌外膜LPS结合,通过破坏细菌外膜渗透性而发的手段,通过电子束对样品外在结构扫描得到三维挥抑菌活性[241。SIF4为金属阳离子抗菌肽【121,带正电立体构造,SIF4对菌体形貌影响见图3。荷,脂多糖由脂质和多糖构成,带负电荷,能与SIF4万方数据:..LIYuzhen,etal:Non—CytoplasmicMembraneDamageAntimicrobialMechanismofMetalAntimicrobialPeptideSIF4AgainstEscherich『,菌体呈清晰杆状,菌体细胞壁膜结构完整且表面平滑。1/2MICSIF4处理后,部分菌体细胞从细胞壁损伤、细胞壁脂多糖竞争性结合、细壁膜变粗糙,出现轻微坍塌,菌体表面开始出现皱胞壁膜组分衍变及菌体形貌改变等方面系统研究缩,细胞壁膜结构完整性遭到一定程度破坏。1MIC了SIF4对基于细胞壁损伤靶点的大肠杆菌非细胞SIF4处理后,菌体除表面出现皱缩和凹陷外,部分菌质膜损伤抑菌机理。研究发现,SIF4可破坏大肠杆菌体的细胞膜出现明显崩塌。2MICSIF4处理后,菌体细胞壁结构,,胞内原生质体有泄与SIF4处理时间和处理剂量呈正相关且组问差异漏,可观测到有部分菌体出现聚集现象。可能是由显著(P<),细胞壁受损可使细胞壁通透性增加;于菌体与SIF4互作后,细胞壁膜结构完整性遭到破SIF4可与大肠杆菌细胞壁脂多糖(LPS)有效结合,。Fr—IR分析发现,SIF4对细胞壁多糖信息区和蛋现聚集。课题组前期研究观察到,SIF4可破坏细胞白质与脂肪酸混合信息区影响最明显,表明细胞壁壁(膜)结构并使胞内容物泄漏,可增强表面疏水性可能是SIF4潜在抑菌效应靶点。。造成细胞聚沉和生物代谢着SIF4处理剂量的增加,菌体形貌可出现壁膜变紊乱[12l,SIF4对菌体细胞壁膜影响机理与抗菌肽糙、轻微坍塌、表面皱缩、表面崩塌、原生质泄漏及P7相似[zTl。细胞聚集等递进现象,SIF。可使菌体形貌发生显著改变。参考文献:[1】LIY,PEIXY,BAIL,:twentyyearsofexperienceandachievements[J].FoodbornePathogensandDisease,202l,l8(8):519—527.[2]吴萱,杨璐,刘艳超,[J】.中国食品卫生杂志,2022,34(2):211—216.[3】张耀文,蔡扩军,[J】.中国畜牧业,2022(13):41-42.[4]刘文双,魏秀丽,赵云亭,—M型超广谱卢一内酰***酶耐药基因的流行传播研究【J】.山东农业科学,2022,54(9):..[5】肖怀秋,李玉珍,林亲录,[J]食品与生物技术学报,2022,41(5):ll一19.【6】肖怀秋,李玉珍,。,2023,42(2):.[7】LIY,QIX,ZHANGQ,:origins,functions,relativemechanismsandapplication[J].Peptides,2012,37(2):207-215.[8]MARASSIFM,OPELLASJ,JUVVADIP,-stateNMRspectroscopy[J].Biophy’sicalJournal,1999,77(6):3152—:..李玉珍,等:金抗肽SIL对大肠杆菌基于细胞壁靶点的非细胞质膜损伤抑菌机理[9】PRIYADARSHINID,,[J].BiophysicalChemistry,2022,281:106721.【10】PANDIDANS,[J].BiophysicsReports,2021,7(3):173-184.[Il】TANTT,、ⅧD,LIWZ,-ationichybridantimicrobialpeptidesbasedonthepeptideFV7[J].InternationalJournalofMolecularSciences,2017,18(2):339.[12]肖怀秋,李玉珍,林亲录,[J】.食品与发酵工业,2022,48(1):.[13]李玉珍,肖怀秋,王琳,【J】.食品与发酵工业,2022,48(20):122-129.[14】【D】.无锡:江南大学,2009.【15】***化氨基酸替换和N端脂肪酸修饰类似物的设计及构效关系研究【D】.兰州:兰州大学,2020.【16】HELMD,·IRspectroscopy[J].FEMSMicrobiologyBiologyLetters,2010,126(1):75·79.【17】ZHANGF,CUIXW,YANR,[J】.Biochemical&munications,2017,485(3):698-704.【18]-bearingandshape-ulusofEscherichiacoli[J].Micro-BiologyandMolecularBiologyReviews,1998,62(1):181—203.[19】HARDERJ,BARTELSJ,CHRISTOPHERSE,-Defensin-3,anovelhumaninduciblepeptideantibiotic[J].JournalofBiologicalChemistry,2001,276(8):5707-5713.【20】ANDOK,,anantibacterialproteinofSarcophagaperegrirt6t,ongrowthofEsckrichiacoli[J].JournalofBiochemistry,1988,103(4):735-739.[2l】BIERBAUMG,[J].ArchivesofMicrobiology,1985,141(3):.[22]PAPON,-negativebacteriafromantimicrobialpeptides[J].JournalofBiologicalChemistry,2005,280(11):10378-10387.[23】—lMPER的抗菌肽设计及抗菌机理研究【D】.吉林:吉林大学,2016.【24】KANAZAWAK,SATOY,OHKIK,(3)tOantimicrobialandharidebindingactivity[J].Chemical&PharmaceuticalBulletin,2009,57(3):240-244.[25】肖怀秋,李玉珍,刘军,【J】.中国酿造,2019,38(5):.[26】NAUMANND,HELMD,-IRspectroscopy[J].Nature,(6321):81-82.【27】LILR,SHIYH,CHENGXR,—ratingpeptideanalogue,P7,exeNsantimicrobialactivityagainstEscherichiaratingcellmembraneandtargetingintracellularDNA[J].FoodChemistry,2015,166:23l--5万方数据t物技木警报2023年第42卷第6期_圈—■■■一

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