DNA细胞周期检测.ppt

该【DNA细胞周期检测 】是由【小可爱】上传分享，文档一共【20】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【DNA细胞周期检测 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。DNA细胞周期检测工作总结商务报告商务展示工作计划基本原理概述正常人静止体细胞有46条染色体,-12pgDNA/细胞核,我们称之为二倍体细胞,而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量。在细胞周期(G0,G1,S,G2,M)的各个时期,DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化:在G1期,细胞开始RNA和蛋白质的合成,但DNA含量仍保持二倍体;KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity进入S期后,DNA开始合成,这时细胞核内DNA的含量介于G1和G2期之间;当DNA复制结束成为4倍体时,细胞进入G2期,G2期细胞继续合成RNA及蛋白质,直到进入M期,因此,单纯从DNA含量无法区分G2期和M期;一旦有丝分裂发生,细胞分裂成两个子细胞,这两个子细胞或者进入下一个细胞周期,或者进入静止期(G0期),而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此,整个复制周期可以描述为G0/G1,S,G2/M期。KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity通过核酸染料标记DNA,并由流式细胞仪进行分析,可以得到细胞各个时期的分布状态,计算出G0/G1%,S%及G2/M/%,了解细胞的增殖能力,在肿瘤病理学研究中,通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。正常细胞具有较恒定的DNA含量,而细胞癌变过程中结构和/或染色体的异常是很常见的。这种变化在流式分析中以DNA倍体指数的形式表现出来,这一指数对于肿瘤的早期诊断,交界瘤、间叶组织肿瘤的良恶性判断提供了重要的辅助指标。KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity流式DNA周期示意图G0/G1静止期及合成前期S合成期G2/M合成后期及分裂期KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity样本制备来源于血液、骨髓、体液、灌洗液、外科手术活检、细针穿刺物等的细胞都可用来做DNA分析。新鲜的、冰冻或固定保存的、或常规固定/包埋用于组织检查的样本均可。通常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本。用组织切片的好处是可以通过观察常规染色来选择感兴趣的区域,缺点是不能再用抗体染色来鉴别肿瘤细胞和正常基质细胞。KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity实体标本的单细胞制备机械法:用剪刀、刀片剪切组织或金属网研磨获取完整的细胞。但该法获取的细胞数量少。化学药品处理法:利用EDTA或Sodiumcitrate结合Ca2+或Mg2+等阳离子,破坏细胞间的连接或用TritonX-100、NP-40破坏细胞膜。该法只能取得细胞核,且易出现核凝集。酶法:利用酶将细胞间的连接物水解,使细胞从组织中分离出。一般常用的为胃蛋白酶及胰蛋白酶。该法也只能取得细胞核。KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity细胞浓度及质量要求单细胞和核的最终浓度应约106/ml。浓度太低,上机时样本的流速不得不提高,这样就会影响检测的CV。浓度太高,则可能导致染料的相对不足,最终使染色不饱和,同样影响CV和检测结果。制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量:细胞是否聚集或过多的碎片;大多数核有肿瘤样的外观(比如说,不是粒细胞)等。保证足够的肿瘤细胞含量;检测S%时建议的最小可接受比例是20%。KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity固定常用70%的冰酒精固定单细胞悬液。应保证样本完全浸没在固定剂中置40C冰箱固定4小时上。对于甲醛固定的组织切片,应注意甲醛会影响PI与核酸的结合。若同时使用抗体鉴别肿瘤细胞,应选择对抗原无损的固定剂。对许多细胞表面抗原来说,固定只能在抗体标记之后进行。KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity多参数分析尽可能地显示FSCvsSSC的双参数图。碎片常常能被区分开来,用设门去除。制备较好的标本中,炎性细胞常可以和肿瘤细胞区分。荧光素标记的抗体常被用来区分正常和肿瘤细胞。如上皮性肿瘤中可用抗cytoketatin的染色来鉴定上皮细胞;在非淋巴细胞肿瘤中,正常的炎性细胞可用白细胞共同抗原CD45来区别;淋巴性肿瘤中则可根据肿瘤的分类选择合适的细胞表面抗原。利用Ki67、PCNA来鉴别G0与G1期、G2与M期。KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity