基因工程.doc

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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。基因工程基因工程基因工程名词解说::启动子(promoter)是基因表达调控的重要顺式元件,是DNA链一段能被RNA聚合酶辨别和结归并能开端mRNA合成的DNA序列,位于构造基因转录开端点上游。:基因工程是指将一种或多种生物体(供体)的基因在体外进行剪切和组合,而后与载体拼接,并通过载体转入到另一种生物体(受体)内,使其依据人们的意向遗传并表达出新的性状。:在克隆载体基本骨架的基础上增添表达元件,使目的基因能够表达的载体。:DNA分子经过与细胞膜联合进入受体细胞并在细胞内稳固保持和表达的过程。:外源DN***段插入到载体的选择标志基因中而使此基因失活,丧失其原有的表性特色。:酵母人工染色体,是进行大片段克隆的线状载体。:当温度忽然降低时,反响系统中寡核苷酸引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。:是以特定的组织或细胞mRNA为模板,逆转录形成的互补DNA与适合的载体连结后转变受体菌形成的重组DNA克隆群。:多个限制酶的单调切点,即多克隆位点。同尾酶:有些根源不一样的限制酶,辨别及切割序列各不同样,但产生出同样的粘性尾端,这种限制酶称为同尾酶。:考斯质粒是一类人工建立的含有λDNAcos序列和质粒复制子特别种类的载体。12穿越载体:是指能在两种不一样的生物中复制的载体。:利用土壤根癌农杆菌中存在着一种引诱瘤细胞的质粒建立成的载体。基因文库:从特定生物个体中分其余所有基因,这些基因以克隆的形式存在(人工建立)。:蛋白质的N未端由原核DNA序列或其余DNA序列编码,C端由真核DNA的完好序列编码,蛋白质由一条短的原核多肽或具其余功能的多肽和真核蛋白质联合在一同,故称融合蛋白。:是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA(cDNA)的酶。尾端转移酶:一种能将脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)加到某DN***段上3′-OH基上的酶。碱性磷酸酶:催化有机单磷酸酯水解为磷酸和甘油的非特异性酶。:根源于稻谷曲霉,是一种高度单链特异的核酸内切酶,催化降解单链DNA或单链RNA,产生以5′-磷酸基尾端的单核苷酸或寡核苷酸的酶。:因为循环次数增添,引物、dNTPs被耗费,酶活性降落,退火时模板互补链间的复性也渐渐增基因工程基因工程基因工程加,扩增效率降落,扩增产物由指数形式变为线性形式,最后出现平台效应。染色体步查:是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发,逐渐探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目的序列的核苷酸构成的方法和过程。:又称反向重复序列,它在DNA或RNA中形成发夹构造,在DNA中有可能形成十字形构造。目的基因:以修饰受体细胞遗传构成并表达其遗传效应为目的的基因。同裂酶:能切割同一靶序列识其余限制性内切酶。衰减子:衰减子是指mRNA分子的前导序列(翻译开端点到5’端间的距离)中控制蛋白质合成速率的调理区。:在mRNA上开端密码子AUG上游4-13个核甘酸以前有一段富含嘌呤的序列,其一致序列为AGGAGG,能够与16srRNA3’尾端的富含嘧啶的序列联合。-互补:LacZ′基因编码的α肽链与失掉了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补,形成的有功能活性的β半乳糖苷酶,这种现象称为α互补。PACE基因组文库简并序列CDNA-RDASSH基因的化学合成DNA体外重组同聚合物加尾法连接物转变感觉态细胞感染转染挑选加强子缄默子停止子衰减子核基质联合区核酸酶限制性内切核酸酶粘性尾端平尾端同切点酶酶的星号活性DNA连接酶DNA聚合酶5’→3’聚合酶活性3’→5’外切酶活性5’→3’外切酶活性TaqDNA聚合酶尾端脱氧核苷酸转移酶外切核酸酶脱氧核苷酸酶1核糖核酸酶A载体克隆载体表达载体质粒载体质粒的不相容性噬菌体载体黏粒克隆载体噬菌粒载体人工染色体质粒表达载体大片段表达载体RNAiVIGS简答题:?(5分)DNA样品的纯度、DNA样品的***化程度、核酸内切酶的缓冲液性质、DNA的分子构造、酶切消化反响的温度作为基因工程的载体应具备哪些条件?(4分)拥有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)?(5分)基因工程基因工程基因工程酵母DNA的端粒(TEL)、DNA复制起点(ARS)、着丝粒(CEN)和必需的选择标志(HISA4和TRP1),建立成YAC克隆载体。基因工程受体细胞应具备的条件?1)限制性缺点型:外切酶和内切酶活性缺点;2)重组整合缺点型:用于基因扩增或高效表达的受体细胞;拥有较高的转变效率;拥有与载体选择标志互补的表型;3)感染寄生缺点型:防备重组细菌扩散污染,生物武器除外。?X1)连结所用的目的片段的状态2)连结温度3)反响液中的成分4)插入片段与载体的浓度比率限制性内切酶的三种切割方式?按切割位点相关于二重对称轴的地点来划分1)一种是在对称轴5’侧切割产生5’粘端,2)另一种是在对称轴的3’侧切割产生3’粘端,3)第三种切割方式是在对称轴处切割,就产平生尾端。?1)辨别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列2)大多半酶的切割位点在辨别序列内部或双侧3)?这种方法是依据组织化学的原理来挑选重组体。主假如在l载体的非必需区插入一个带有大肠杆菌b—半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的l载体转入lac的宿主菌后,在含有5—溴—4—***—3—引哚—b—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插人lac(或lac基因部分被代替)后,重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力,转入lac-宿主菌后,在含有5—溴—4—***—3—引哚—b—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。画图说明怎样实现目的基因的定向连结?基因工程基因工程基因工程建立质粒克隆载体的基本策略有哪些?基因工程基因工程基因工程(1)能在受体细胞中有效复制,并且有许多的拷贝数,选择废弛型质粒复制开端子(Ori)。2)含有尽可能多供外源DNA克隆的位点(MCS)。3)一定含有供选择克隆子的标志基因。(4)克隆载体DNA的分子量尽可能的小,转变效率高,插入的外源片段较大。(5)依据需要,组装各样“元件”,建立不一样用途的载体。T4-DNA酶的基本特征有哪些?1)5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性。2)在无dNTP时,能够从任何3‘-OH端外切。3)在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸裸露时停止。4)在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位。基因文库的质量标准有哪些?(1)重组克隆的总数不宜过大以减少挑选工作的压力(2)载体的装载量最好大于基因的长度防止基因被分开克隆(3)克隆与克隆之间一定存在足够长度的重叠地区以利克隆排序4)克隆片段易于从载体分子上完好卸掉5)重组克隆能稳固保存、扩增、挑选Klenow酶的基本用途有哪些?1)补平由核酸内切酶产生的5‘粘性尾端2)DN***段的同位素尾端标志3)cDNA第二链的合成4)?(8分)DNA提取及片段化载体的选择及制备。DN***段与载体连结。重组体转变宿主细胞。转变细胞的挑选。,建立基因组文库需要用到哪些载体?基因工程基因工程基因工程(1)提取目的基因→?酶切→?连结到另一DNA分子(克隆载体)→?重组DNA分子基因工程基因工程基因工程2)转变:将重组DNA分子转入受体细胞、复制、保存3)挑选和判定:对汲取了重组DNA的受体细胞进行挑选和判定4)检测:对含有重组DNA的细胞培育,检测外源基因的表达。质粒、λDNA、考斯质粒、BAC、YAC怎样对大肠杆菌的λ噬菌体DNA进行改造用作基因工程载体?(1)l-DNA载体的建立:缩短长度(2)l-DNA载体的建立:删除重复的酶切位点(3)l-DNA载体的建立:加装选择标志(4)l-DNA载体的建立:建立琥珀密码子的突变体基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些?1)))T4噬菌体DNA聚合酶4)T7DNA聚合酶5)TaqDNA聚合酶6)?重组体分子的选择方法主要有哪些?并简单论述其原理。(?)(一)遗传表型直接挑选法(1)依据载体选择标志初步挑选转变子(抗药性挑选法/插入表达法/插入失活挑选法/显色互补挑选)2)营养缺点型检测法3)形成噬菌斑挑选法(二)依靠于重组子构造特色剖析的挑选法(三)核酸分子探针杂交检测法(四)免疫化学检测法(五)基因表达产物剖析法(六)DNA测序法怎样提升克隆基因的表达水平?基因工程基因工程基因工程(1)增添基因的拷贝数基因工程基因工程基因工程建立增添转录的载体3)建立交融型载体4)建立分泌型克隆表达载体克隆基因目的蛋白的表达的形式主要有哪些种类?非交融蛋白、交融蛋白、分泌蛋白什么叫转基因植物?植物转基因技术的基本路线主要包含哪些?经过重组DNA技术人工插入其余物种基因以创建出拥有新特征的植物。目的基因的分别将目的基因克隆到适合的载体DNA中形成重组DNA,并且连结了一个控制目的基因转录表达的启动子和一个控制目的基因转录停止的停止子,还连结一个编码特别蛋白质(如荧光蛋白)的标志基因。利用细菌生殖扩增重组DNA。利用基因枪、农杆菌等方法将连结了启动子和停止子的目的基因导入到目标植物的细胞中。挑选含有外源基因的转变细胞,并引诱产生转基因植株。大规模栽种转基因植物。外源基因导入植物的方法主要有哪些?(?)第一类:交融法,包含细胞交融,微细胞介导交融。第二类:化学法,包含DNA-磷酸钙积淀法,DEA葡聚糖法,染色体介导法。第三类:物理法,显微注射法,电脉冲法,细胞速冻存法,基因枪法。第四类:感染法:重组DNA病毒感染法,农杆菌介导感染法。(一)DNA直接转移法1)化学刺激法;2)电击法;3)显微注射法;4)基因抢法;5)脂质体介导法;6)微激光束法;7)花粉通道法;(二)载体介导法1)农杆菌介导法;2)植物病毒DNA介导法:出现转基因缄默现象的可能原由剖析。(?)(1)DNA序列的***化。往常是胞嘧啶***化形成5’-***胞嘧啶。在转基因的启动子区,高GC序列区是***化的目标。(2)重复拷贝之间的异位配对。基因工程基因工程基因工程多拷贝的转基因串连染色体同一位点或分别在不一样位点,均不一样程度致使转基因失活。基因工程基因工程基因工程重复基因共同作用时,可能经过异位配对造成染色体的构型改变,从空间构造上阻挡转录因子与转基因的接触,致使基因处于封闭状态,形成基因缄默。(3)转录后调控的影响基因工程基因工程基因工程转基因转录启动后,转录酶将以连续方式产生正常RNA和反义RNA,两者形成dsRNA,扰乱mRNA的基因工程基因工程基因工程加工与转译,形成衰败调控(down-regulation)。转基因转录启动后,mRNA的加工、转移与输出遇到克制。基因工程基因工程基因工程/1)地点效应基因工程基因工程基因工程2)DNA序列的***化基因工程基因工程基因工程3)重复拷贝之间的异位配对4)?PCR?反响的后期,或许循环次数过多时,反响系统中就会出现一种所谓的平台效应(Plateau?effect),请问什么叫平台效应?产平生台效应的原由有哪些?平台效应:PCR进行到必定次数后产物的累积由指数方式向线性方式变化或反响根本停止。/PCR扩增过程后期会出现的产物的累积按减弱的指数速率增添的现象。原由:1)底物与引物的浓度降低2)dNTP和DNA聚合酶的稳固性或活性降低3)产生的焦磷酸会出现尾端产物克制作用4)非特异性产物或引物的二聚体产生非特异性竞争作用5)扩增产物自己复性6)高浓度扩增产物变性不完全PCR引物设计要注意哪些问题?(1)长度一般最低许多于16个核苷酸,而最高不超出30个核苷酸,最正确长度为20~24个核苷酸。(有时可在5’端增添不与模板互补的序列,如限制性酶切位点或加强因子等,以达成基因克隆和其余特别需要,但要在酶切位点的5’端加上额外的3-4个核苷酸,以保证附带的酶切位点有效。)(2)两个引物之间不该发生互补,特别是在引物3’端,即便没法防止,其3’端互补碱基也不该大于2个碱基,不然易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”(Primerdimer)。(3)(G+C)%含量引物的构成应平均,尽量防止含有同样的碱基多聚体。两个引物中(G+C)%含量应尽量相像。4)ontentbetween40-60%(5)引物内部应防止内部形成显然的次级构造,特别是发夹构造(hairpinstructures)。基因工程基因工程基因工程影响原核细胞中影响翻译开端的要素有哪些?(1)开端密码子(2)核糖体联合位点(SD序列)的碱基构成(3)开端密码与SD序列之间的距离(S-D序列与开端信号之间的距离对翻译效率起侧重要的作用。不一样的距离表达产物的量有时可产生2000倍的差距。甚至有时仅相差2-3个bp,而蛋白质产量相差20倍。例Lac启动子的S-D序列距AUG7nt时表达最高,为2581单位,而相距8nt时表达水平降到不足5个单位。)4)mRNA的二级构造5)mRNA上游的5‘端非翻译序列6)蛋白编码区的5‘端序列实现外源基因mRNA有效翻译须考虑问题?(1)AUG(ATG)是首选的开端密码子。(2)SD序列为与核糖体16SrRNA互补联合的位点,该序列起码含有AGGAGG序列中的的4个碱基。(3)SD序列与翻译开端密码子之间的距离为3?9个碱基。(4)在翻译开端区的四周的序列不易形成显然的二级构造。真核细胞的mRNA的5'非翻译区不存在SD序列,mRNA的开端序列都含有共同的序列5'-CCA(G)CCATGG-3',假如改变,可使翻译的开端效率大大降低。启动子有哪些特色?(1)序列特异性。启动子往常含有几个守旧的序列框,序列框中碱基的变化会致使转录启动的滞后和转录速度的减慢。(2)方向性。启动子是一种有方向性的顺式调控元件,在正反两种方向中只有一种拥有启动功能。(3)地点特征。启动子只好位于所启动转录基因的上游或基因内的前端,处于基因的下游或在基因的上游但离所要启动的基因太远,一般都不会起作用。(4)种属特异性。原核生物的不一样种、属,真核生物的不一样组织都拥有不一样种类的启动子。亲缘关系愈近的两种生物,启动子通用的可能性也越大。原核和真核生物的启动子有共同序列。要实现外源基因在原核生物细胞中表达应注意哪些问题?基因工程基因工程基因工程(1)选择适合的多拷贝载体将外源基因导入宿主细胞中表达;基因工程基因工程基因工程(2)外源基因不可以有内含子,须删除内含子和5’非编码区;(3)一定利用原核的强启动子和S-D序列,S-D序列和开端密码子的距离要适合;(4)外源基因与表达载体连结时,要能形成正确的开放读框(ORF)。(5)要利用调控系统使产物尽可能高效表达,并防备外源基因产物对宿主菌的迫害。影响限制性核酸内切酶活性的要素?一、判断题将同聚物尾巴加到了线性双链或单链DNA分子的3’-OH尾端的酶为DNA尾端转移酶。(√)碱性磷酸酶能够去除DNA,RNA或dNTP的5’磷酸基团。(√)。(√),在书写时要斜体。(√),在DNA序列中出现的几率就越大。(√)’侧切割产生5’粘端。(√)’→5’核酸外切酶活性。(X)进行双酶切时,假如酶对盐浓度要求同样,原则上能够同时进行酶切。(√)质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳固遗传的一类核酸分子。(√)绝大多半的天然DNA质粒拥有共价、封闭、环状的分子构造。(√)质粒DNA携带控制自己复制和转移的基因,还携带一些表型基因,进入寄主细胞后,给予寄主细胞产生新的表型。(√)拥有相像的复制子构造的质粒一般相互不相容。(√),其装载量范围在50-300kb之间。(√)。(X):需要已知待扩增目的基因或DN***段双侧的序列,再依据该序列化学合成聚合反响必需的双引物。(√)。(√)cDNA文库的信息量远小于基因组文库(√)基因工程基因工程基因工程用于基因组文库建立的DNA在分别纯化操作中应尽量防止过分的断裂。(√)基因工程基因工程基因工程大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆构成。除了一些拥有特别功能的蛋白质编码基因(如抗药性基因、联合蛋白编码基因等)能够采纳特别的正选择挑选程序(如抗药性挑选法、酵母双杂交技术等)直接挑选外,一般的基因组文库挑选均需多轮挑选。(√),产生的片段数等于酶辨别序列数之和。(X)***段,连结后可保存原有的酶辨别序列,也可能产生新的辨别序列。(√)***段加尾,既能够使两个平尾端DN***段进行连结,也可使平尾端DN***段和粘性尾端DN***段进行连结。(√)将DN***段5’尾端脱磷酸化,可使防备DN***段会自己连结环化或连结成多聚体。(√)PCR就是体外复制扩增DNA分子。(√)。(√)PCR扩增时,Mg2+浓度直接影响酶活性和忠实性,还影响引物的退火、模板和产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的形成。(√),K+浓度小于50mmol/L,有益于引物退火,大于50mmol/L,克制Taq酶活性。(√)惯例PCR循环次数一般为25~40个周期。一般是循环次数过多,非特异性背景严重,复杂度增添。自然循环反响的次数太少,则产率偏低。(√),反响溶液一定要有两种不一样的DNA聚合酶(√)植物细胞原生质系统统长处是体外简单达成细胞操作和遗传操作,能够发生细胞交融,直接高效捕捉外源基因。(√)利用基因枪法转基因时,往常将外源基因吸附到金粉上。√-DNA链的合成是从右界限开始,即5’→3’,若TR缺失,不可以合成T链。(√),能够将T-DNA复合物定向核孔。(),保持mRNA的有效延长、停止及稳固存在是外源基因有效表达的重点。(√),对基因转录进行开关式的微调作用。(√)基因工程基因工程基因工程绝缘子在真核生物基因组中,既是基因表达的调控元件,也是一种界限元件。(√)内容总结(1)名词解说::启动子(promoter)是基因表达调控的重要顺式元件,是DNA链一段能被RNA聚合酶辨别和结归并能开端mRNA合成的DNA序列,位于构造基因转录开端点上游(2):在克隆载体基本骨架的基础上增添表达元件,使目的基因能够表达的载体(3):多个限制酶的单调切点,即多克隆位点基因工程基因工程基因工程