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黑翅土白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶、编码基因、载体及应用的制作方法.docx


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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。黑翅土白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶、编码基因、载体及应用的制作方法专利名称:黑翅土白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶、编码基因、载体及应用的制作方法技术领域:本发明涉及一种黑翅土白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶、编码基因、载体及应用。背景技术:木质纤维素类物质是植物界中最为丰富的天然高分子化合物,是植物通过光合作用产生的主要干物质。据估计,全世界绿色植物每年光合作用产生的干物质达1730亿吨,所合能量为2Χ1021焦耳,相当于全世界每年消耗能量的10倍(李忠仁,生物能源的开发和利用,延边大学农学学报,2003,25(3)225227)。纤维素的酶降解需要纤维素酶的参与,纤维素酶并不是一种简单的酶,而是由若干种相互关联的酶组成的一个复杂的酶系统。一般来说,纤维素酶主要由三类组成(1)内切-β-1,4-葡聚糖酶(Endo—^-l,4-glucanase,),主要作用于纤维素分子内部的非结晶区,随机水解β_1,4糖苷键,将长链纤维素分子链截短,产生大量带有非还原性末端的小分子纤维素和可溶性纤维寡聚糖;(2)外切-β_1,4-葡聚糖酶(Εχο-β-1,4-glucanase,),主要作用于纤维素分子链的非还原末端,水解β_1,4糖苷键,产生纤维二糖;(3)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,),水解上述两种酶产生的纤维二糖和其他低聚糖,生成葡萄糖(CoughlinMP,,1988,11-30;GoyalA,,1991,36(1)37-50;,1997,6:16-17;严岩,、,1997,1:17-20)。随着全球人类的增长和多数国家的工业化发展,能源的消耗在急剧增加,能源危机日益严重,因此寻找新的石油替代品一直是众多科技工作者关注的问题。近年来,燃料乙醇作为石油能源的替代物,逐渐成为世界各国研究的热点。在美国,乙醇已被广泛应用在汽车燃料中取代部分石油,它们在石油燃料中加入部分乙醇,以减少石油的使用。这样既可以减少环境污染,又可以节省能源,减少成本。目前,美国等国家在混合燃料中所使用的大量乙醇都是由谷物发酵而产生的,这样成本较高,并且还会消耗掉大量的粮食。我国是一个农业大国,农林生产中所产生的生物质种类多,产量巨大,较常见的有枝桠材、稻壳、植物秸秆、玉米芯、锯末、碎木块、甘蔗渣、薪柴、禽畜粪便和城市垃圾等,是仅次于煤炭、石油和天然气的第四位能源。然而,每年用于工业过程或燃烧的木质纤维素仅占所产生木质纤维素的2%(,2003,25(3):225_227;王超,,2003,11(4)52-59)。如果用高活性的木质纤维素酶将这些木质纤维素降解产生还原糖,再进一步发酵生产乙醇,这样既可以降低制造成本,还可以变废为宝,为燃料和能源工业服务。自然界中,纤维素酶广泛存在于细菌、真菌、软体动物、原生动物、甲壳动物和一些昆虫如蟑螂、天牛、白蚁等的体内。其中,人们对细菌、真菌体内的纤维素酶研究得最多,而对昆虫体内的纤维素酶则研究得较少。目前有关昆虫体内纤维素酶的研究主要集中在天牛和白蚁的一些种类上。白蚁是一类以木质纤维素为主要食源的古老生物,在地球物理循环和能量流动中起着十分重要的作用。在长期的进化过程中,白蚁为了适应纤维素类食物的消化,体内形成了非常高效的降解纤维素的纤维素酶系统。近几十年的研究结果表明,白蚁体内的纤维素酶主要由内切_0-1,4-葡聚糖酶和0-葡糖苷酶组成,在一定条件下,这两种酶也具有外切-0-l,4-葡聚糖酶活性。在澳白蚁科、草白蚁科、木白蚁科、鼻白蚁科和齿白蚁科白蚁体内,纤维素的消化由白蚁自身分泌的纤维素酶和体内共生生物分泌的纤维素酶协同完成;在白蚁科白蚁体内,纤维素的消化则主要依赖头部唾液腺或中肠上皮细胞分泌的内源性纤维素酶(:,333(1267):281_288;李捃,,1999,16(2)1-7;NakashimaK,ffatanabeH,-digestingsystemofthewood-feedingtermite,,2002,32:777_784)。在当前利用纤维素酶降解纤维素的生产工艺中,最困扰人们的是如何提高纤维素酶的酶解效率和降低纤维素酶的生产成本(,9(3):116-118,135)。从自然界中寻找高活性的纤维素酶和利用分子生物学技术改造纤维素酶基因,进而开发活性高、热稳定性好、底物范围广、耐酒精能力强的纤维素酶生物工程菌,是解决这一问题的有效途径。发明内容本发明目的是提供一种黑翅土白蚁内切-0-1,4_葡聚糖酶、编码基因、载体及应用。本发明采用的技术方案是一种内切-0-1,4-葡聚糖酶,含有与5£%以上的氨基酸序列。由于氨基酸序列的特殊性,%以上的片段或其变体,如其保守性变体、生物活性片段或衍生物,均属于本发明保护范围之列。具体的改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换;其中,对于变体的保守性改变,所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质,如用亮氨酸替换异亮氨酸,变体也可具有非保守性改变,如用色氨酸替换甘氨酸。或者,所述的内切-3-l,4-葡聚糖酶,%以上的氨基酸序列。在本发明中,术语“内切-3-1,4-葡聚糖酶”、“黑翅土白蚁内切_3-1,4-葡聚糖酶”或“酶OfEG”都可互换使用,该术语包括含有信号肽的多肽以及不含信号肽的成熟的内切-3-l,4-葡聚糖酶。在本发明中,术语“内切-3-1,4-葡聚糖酶”指具有内切-3-1,4-(第1-448位)或成熟序列(第17-448位,)的多肽。该术语还包括具有内切-0-l,4-。这些变异形式包括(但并不限于)若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括内切-0-l,4-葡聚糖酶的活性片段和衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体,诱导突变体,在高或低的严谨度条件下能与内切-0-1,4-葡聚糖酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还提供了其他多肽,如包含内切-0-l,4-葡聚糖酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外,本发明还包括了内切-日-1,4-葡聚糖酶的可溶性片段。通常,该片段具有内切-3-1,4-葡聚糖酶序列的至少约10个连续氨基酸,通常至少约30个连续氨基酸,较佳地至少约50个连续氨基酸,最佳地约70个连续氨基酸。发明还提供内切-0-1,4_葡聚糖酶或多肽的类似物,这些类似物与天然内切-1,4-葡聚糖酶的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的修饰形式上的差异,或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到,如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变,还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如0、Y氨基酸)的类似物。应理解,本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括;体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸,磷酸丝氨酸,磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。本发明所述内切-0-1,4-葡聚糖酶,()氨基酸残基序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。优选的,所述的内切-3-l,4-葡聚糖酶,。、缺失或添加而形成的,且具有内切-1,4-葡聚糖酶活性的多肽。优选的,所述的内切-0-1,4_葡聚糖酶,。、缺失或添加而形成的,且具有内切-1,4-葡聚糖酶活性的多肽。本发明还涉及一种编码所述内切-1,4_葡聚糖酶的基因。该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70%相同性(a);(b)()的核苷酸序列;(c)()的核苷酸序列(d)()氨基酸残基序列的多核苷酸;(e)。由于核苷酸序列的特殊性,任何前述多核苷酸的变体,只要其与该多核苷酸具有70%以上同源性,均属于本发明保护范围之列。在本发明中,术语“编码内切-0-1,4_葡聚糖酶的多核苷酸”指编码具有内切-0-1,4-葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列,如3£。,有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性,%。。该术语还包括能在中度严紧条件下,更佳地在高度严紧条件下,。%,较佳地至少80%,更佳地至少90%的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与内切-1,。这些变异形式包括(但并不限于)若干个核苷酸的缺失、插入或取代,以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸。本发明还包括内切-0-1,4_葡聚糖酶多肽编码序列及其片段的反义序列,这种反义序列可用于抑制细胞内内切-0-l,4-葡聚糖酶的表达。优选的,。或者,。本发明还涉及一种含有所述基因的重组载体。以及利用所述重组载体转化、转导或转染得到的宿主细胞。本发明中,编码内切-0-1,4_葡聚糖酶的核苷酸序列可插入到载体中,以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体还包括但不限于在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体;。总之,只要能在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体,优选PET载体系列以及其它原核表达载体系列。表达载体一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌,枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、和哺乳动物细胞,较佳地,该宿主细胞是真核细胞,如Tn细胞、CH0细胞、COS细胞等。本发明还涉及所述的基因在制备内切-0-1,4_葡聚糖酶中的应用。具体方法包含(a)在适合表达该内切-0_1,4-葡聚糖酶的条件下,培养上述被转化或转导的宿主细胞;(b)从培养物中分离出该内切-0-l,4_葡聚糖酶。本发明发现了一种编码黑翅土白蚁内切-0-1,4_葡聚糖酶的基因,该基因可在宿主细胞中大量表达以生产该内切-0-l,4_葡聚糖酶,用于纤维素的降解,实验证明本发明的内切-0-1,4-葡聚糖酶的酶活达1901本发明所提供的内切-0-1,4_葡聚糖酶及其编码基因可应用于纤维素的降解。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1黑翅土白蚁内切-1,4_葡聚糖酶基因(OfEG)(取自浙江杭州)的唾液腺,并将获得的腺体迅速至于Trizoldnvitrogen)溶液中,迅速抽提其总RNA,并以oligo(dT)18为引物反转录生成cDNA。以反转录的cDNA为模板,用一对特异性引物(Primer1-ttaacga-3‘,aatgcgtaatcga-3')进行PCR扩增,将扩增到的片段进行T载体(Promega)克隆,并对其进行序列测定(Invitrogen)。根据测序得到的结果设计特异性引物(Primer35,-aacga-3,,Primer4:5,-gtagtaactgttggcgtcggtga-3,),分别用于扩增编码OfEG全长cDNA的3’及5’端。以总RNA为模板,利用3’及5’RACE试剂盒(Takara-Clontech),参照试剂盒说明书,分别扩增该基因的3’端及5’端序列。分别对扩增到的片段进行

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