鲫肝细胞原代培养方法.docx

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公司。5)Percoll分离液用Percoll原液(上海旭飞生物有限公司)与lOXD-hank,s以9:1的比例配置成分离液I;用配置成的分离液I和lXD-hank’s按2:3的体积比配成分离液II。6)D-hank,s溶液将8gNaCl,、·12Η20、0·06gΚΗ2Ρ04、,高温高压灭菌,待温度下降后于4°C保存。7)%-hank’S中,4°C过夜混勻,。用注射滤器过滤除菌,小瓶分装(离心管)于-20°C冻存。8)实验动物健康鲫3只,体重300g。实验操作遵照国家动物保护法执行。2操作步骤1)采取适当的解剖方式,从健康的鲫中分离出肝组织。试验鱼暂养3天,取健康鲫,首先剪断其鳃部脉弓,放血5min,用酒精擦拭鱼体表消毒,在超净工作台内解剖鲫,并取肝组织,为了减少细菌的污染,用葡萄糖洗必泰(***苯双胍己烷)浸泡离体组织lOmin。用D-hank’s漂洗2次至无血色。2)用眼科剪将组织剪成2_3mm3的碎块,置于烧杯中。3)为了提高消化效果采用分步消化的方法消化组织。将剪碎的组织倒入离心管,置入28°C的水浴锅内。首先加入组织量4-5倍体积的胰蛋白酶和EDTA消化,期间不停摇勻,15min消化完毕后。4)离心去上清,加3ml的D-hank’s同组织混勻后lOOOrpm,5min离心,去除残留的胰蛋白酶和EDTA,终止消化。5)向所得的沉淀组织中加3-4倍体积的II型胶原蛋白酶和CaCl2置入28°C水浴锅,期间不停摇勻。6)每隔IOmin后取出3/4的上清液移入另一个离心管。在烧杯中添加新的II型胶原蛋白酶和CaCl2继续消化组织块。7)30min