高产安丝菌素发酵工艺的制作方法.docx

该【高产安丝菌素发酵工艺的制作方法 】是由【421989820】上传分享，文档一共【9】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【高产安丝菌素发酵工艺的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。高产安丝菌素发酵工艺的制作方法高产安丝菌素发酵工艺的制作方法本发明公开了高效大规模生产安丝菌素的发酵工艺,该工艺显著特征是首先进行补料分批发酵,随后转换为重复补料分批发酵。本发明还公开了一种生产安丝菌素的培养基以及由发酵液获取高纯度安丝菌素的精制方法。【专利说明】高产安丝菌素发酵工艺【技术领域】[0001]本发明涉及生产安丝菌素的培养基及一种新型安丝菌素发酵工艺和精制方法,属于生物工程和生物【技术领域】。【背景技术】[0002](含量为千万分之二)首先分离得到美登素,其母核为19-C的大环内酰***或I型多聚***类,后来发现珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnemapretiosum)也能产生与其类似的多种产物,将之称为美登素类抗生素,在限定的培养条件下,安丝菌素P-3(AP-3)是其主要成分。因它对各种肿瘤,如L-1210、P-388白血病、S-180、W-256、路易斯肺癌和体外鼻咽癌均有显著疗效,从而具有巨大的应用前景,例如目前AP-3作为免疫***结合剂的方式治疗恶性肿瘤的临床试验已进入最后阶段。因此,未来市场对AP-3的需求将是大量的,从而高效大规模生产AP-3已成为研究热点之一O[0003]高效大规模生产AP-3,主要从三个方面入手。一是获得AP-3高产菌株,二是得到利于高产菌株生长和代谢的培养基,三是探索应用适合的发酵工艺。目前报道的AP-3高产菌株通过基因改造和诱变的手段获得。Bandi等(,biotechnol.(2006),16(9),1338~1346)31565的asm2(AP-3生成相关基因)删除,AP-/L,之后通过响应曲面方法优化其培养基组成,AP-(JIndMicrobiolBiotechnol(200936:1345~1351))分别将asm2和asm39上调表达,使得AP-3含量分别提高到33mg/L和52mg/L。辛西亚?31565经紫外和化学试剂两轮诱变,获得变异菌株ActinosynnemapretiosumPF4-4,在其限定的培养基`和补料分批发酵工艺下,900L/1500L发酵罐水平AP-3含量达到304mg/L(101103120A,WO03/064610A2)。这也是目前报道的AP-3最高发酵水平和最大发酵规模。【发明内容】[0004]本发明提供了一种安丝菌素高效发酵工艺,其特征在于,首先进行补料分批发酵,随后转换为重复补料分批发酵。在一个实施方案中,在补料分批发酵阶段,使用发酵培养基发酵一段时间后,向发酵液中加入异丁醇,继续发酵一段时间后,向发酵液中流加葡萄糖;继续发酵一段时间后,进入重复补料分批发酵阶段,放掉发酵液的一部分,补加发酵培养基并向发酵液中加入异丁醇,一段时间后,向发酵液中流加葡萄糖。[0005]在一个实施方案中,在所述发酵工艺的补料分批发酵阶段,使用发酵培养基发酵2~3天后,-%(v/v)的异丁醇,发酵进行4飞天后,向发酵液中流加葡萄糖,流加速率为3~10g/L/d;发酵进行8~12天后,进入重复补料分批发酵阶段,放掉发酵液的30~50%,-%(v/v)的异丁醇,在重复补料分批发酵阶段开始2~4天后,向发酵液中流加葡萄糖,流加速率为3~10g/L/d,重复补料分批发酵阶段持续时间为7~10天。[0006]在一个实施方案中,所述发酵工艺参数为,%~%(v/V),温度25~30。。,~,DO(溶氧)20%~60%,~,-(airvolume/culturevolume/min,通气比),揽拌速度100~300rpm。[0007]在一个优选的实施方案中,所述发酵工艺参数为,%(v/V),温度28°C,,DO40%,,,搅拌速度160rpm。[0008]在一个实施方案中,所述发酵工艺中pH的控制是通过自动流加NH3*!120和30%醋酸来实现的。[0009]在一个实施方案中,31565。发酵种子为利用发酵培养基,从珍贵橙色束丝放线菌的平板上挑取单菌落,在280C260rpm摇床培养4~6天获得的。[0010]在一个实施方案中,所述发酵工艺使用的发酵培养基,其碳源为乳糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉、糊精、果糖及葡萄糖中的一种或其混合,其氮源为花生饼粉、大豆粉、酵母粉、蛋白胨、玉米浆、甘氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸中的一种或其混合。其中,%~%,%~%。[0011]在一个优选的实施方案中,%~%%~%糊精的混合;%~%玉米浆、%~%%~%缬氨酸的混合。[0012]在一个更优选的实施方案中,%%糊精的混合;%玉米浆、%%缬氨酸的混合。[0013]在一个实施方案中,%、%~%ΚΗ2Ρ04、%~%%~%消泡剂。[0014]在一个优选的实施方案中,%,%,%,%。[0015]本发明还涉及在发酵完成后,用水溶性提取试剂从发酵液中纯化安丝菌素,具体地包括如下步骤:[0016](I)灭活发酵液中微生物;[0017](2)向发酵液中加入50%~80%提取试剂,实现安丝菌素的抽提及去除固形物;[0018](3)通过离心或过滤去除菌体及固形物,得到发酵上清液,-%(质量比)的絮凝剂,静置6~16h,以去除残留物。其中采用的絮凝剂选自硫酸铝、***化铁及硫酸铝钾中的一种或其混合;[0019](4)采用硅胶层析手段,实现初步分离发酵液中安丝菌素;[0020](5)采取蒸发的方法浓缩安丝菌素;[0021](6)采取高效液相色谱的方法精制安丝菌素。[0022]在一个实施方案中,通过加热和/或调节发酵液pH的方法灭活发酵液中微生物。[0023]在一个优选的实施方案中,通过将发酵液加热至60_70°-(搅拌或不搅拌)以灭活发酵液中微生物。[0024]在一个优选的实施方案中,---(搅拌或不搅拌)以灭活发酵液中微生物。[0025]在一个实施方案中,所采用的提取试剂是醇类及酸酯类中的一种或其混合,其中醇类选自甲醇、乙醇、丙醇的一种或其混合,酸酯类选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯的一种或其混合。【专利附图】【附图说明】[0026]图1为使用Design-Expert软件探索不同培养基成分对AP-3发酵影响的2IV8-3析因设计效应分析图(半正态图,Half-NormalPlot),其中横坐标为标准化效应(StandardizedEffect),纵坐标为半正态概率(Half_Normal%ProbabiIity)。[0027]图2为采用HPLC检测发酵液中AP-3浓度而建立的AP-3标准曲线。[0028]图3为采用葡萄糖检测试剂盒检测发酵液中葡萄糖而建立的葡萄糖标准曲线。[0029]图4为采用15L-罐发酵,AP_3、pH、PCV(细胞压缩体积)随时间变化的过程曲线。[0030]图5为采用150L-罐进行补料分批发酵,AP_3、pH、PCV、葡萄糖浓度随时间变化的过程曲线。[0031]图6为采用150L-罐将补料分批发酵和重复补料分批发酵相结合,AP_3、pH、PCV、葡萄糖浓度随时间变化的过程曲线。[0032]图7为使用HPLC检测AP-3纯度的数据。【具体实施方式】[0033]提供以下实施例,以方便本领域技术人员更好地理解本发明,所述实施例仅出于示例性目的,并非意在限制本发明的范围。[0034]实施例中用于菌种划线的`平板培养基配方见表1。[0035][0036]【权利要求】,其特征在于,首先进行补料分批发酵,随后转换为重复补料分批发酵。,其特征在于,在补料分批发酵阶段,使用发酵培养基发酵一段时间后,向发酵液中加入异丁醇,继续发酵一段时间后,向发酵液中流加葡萄糖;继续发酵一段时间后,进入重复补料分批发酵阶段,放掉发酵液的一部分,补加发酵培养基并向发酵液中加入异丁醇,一段时间后,向发酵液中流加葡萄糖。,其特征在于,在补料分批发酵阶段,使用发酵培养基发酵2~3天后,-%(ν/ν)的异丁醇,发酵进行4飞天后,向发酵液中流加葡萄糖,流加速率为3~10g/L/d;发酵进行8~12天后,进入重复补料分批发酵阶段,放掉发酵液的30~50%,-%(ν/ν)的异丁醇,在重复补料分批发酵阶段开始2~4天后,向发酵液中流加葡萄糖,流加速率为3~10g/L/d,重复补料分批发酵阶段持续时间为7~10天。,其参数为,%(ν/V),温度25~30。。,~,DO(溶氧)20%~60%,~,~(airvolume/culturevolume/min,通气比),揽拌速度100~300rpm;进一步优选为,%(v/v),温度28°C,,D040%,,,搅拌速度160rpm。,其特征在于使用的发酵菌种为珍贵橙色束丝放线菌(ActinosynnemaPretiosum)31565及其衍生菌株。-5任一项所述发酵工艺的发酵培养基,%~%%~%糊精的混合;%~%玉米浆、%~%%~%缬氨酸的混合。,%%糊精的混合;%玉米浆、%%缬氨酸的混合。,%~%、%~?.0%ΚΗ2Ρ04、%~%%~%消泡剂;%,%,%,%。,其还包括在发酵完成后,用水溶性提取试剂从发酵液中纯化安丝菌素,具体地包括如下步骤:(1)灭活发酵液中微生物;(2)向发酵液中加入50%~80%提取试剂,实现安丝菌素的抽提及去除固形物;(3)通过离心或过滤去除菌体及固形物,得到发酵上清液,%~%(质量比)的絮凝剂,静置6~16h,以去除残留物,其中采用的絮凝剂选自硫酸铝、***化铁及硫酸铝钾中的一种或其混合;(4)采用硅胶层析手段,实现初步分离发酵液中安丝菌素;(5)采取蒸发的方法浓缩安丝菌素;(6)采取高效液相色谱的方法精制安丝菌素。,所述提取试剂是醇类及酸酯类中的一种或其混合,其中醇类选自甲醇、乙醇、丙醇的一种或其混合,酸酯类选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯的一种或其混合。