骨髓染色体提取试剂盒的制作方法.docx

该【骨髓染色体提取试剂盒的制作方法 】是由【421989820】上传分享，文档一共【18】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【骨髓染色体提取试剂盒的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。骨髓染色体提取试剂盒的制作方法骨髓染色体提取试剂盒的制作方法本发明公开了一种骨髓染色体提取试剂盒,该试剂盒是由试剂1、试剂2、试剂3和试剂4组成的液体型试剂,其中试剂1为以下成分的混合物:RPMI1640培养基,青霉素/链霉,胎牛血清和人类淋巴瘤细胞培养物。此种试剂盒提取出的骨髓染色体悬液制作出的G带,具有以下优点分裂相更多,省时省力;分裂相中染色体的长度更长,带纹更加清晰;分散度更加良好,便于分析;异常染色体检出率更高,诊断结果更加可靠。因而,用于骨髓染色体核型分析时准确性更高,具有更广泛的应用前景。【专利说明】骨髓染色体提取试剂盒【技术领域】[0001]本发明属生命科学和生物【技术领域】,特别涉及一种骨髓染色体提取的试剂盒,用于进行骨髓染色体核型分析。[0002]【背景技术】[0003]G显带因为染色体主要是被Giemsa染料染色后而显带,故称之为G显带技术,其所显示的带纹分布在整个染色体上。人们将用各种不同的方法,以及用不同的染料处理染色体标本后,使每条染色体上出现明暗相间,或深浅不同带纹的技术称为显带技术(bandingtechnique)。本世纪70年代以来,显带技术得到了很大发展,且在众多的显带技术中(Q带、G带、C带、R带、T带),G带是目前被广泛应用的一种带型。[0004]研究发现,人染色体标本经胰蛋白酶、NaOH、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后,再用Giemsa染色,可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹,这就是染色体的G带。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征,所以G显带后,可以较为准确的识别每条染色体,并可发现染色体上较细微的结构畸变。[0005]近年来,随着分子生物学与细胞遗传学的发展,骨髓染色体核型分析在血液系统疾病的诊断、治疗和预后中发挥了越来越重要的作用。骨髓染色体的制备因骨髓中有大量脂肪颗粒的干扰,骨髓中各种细胞系的细胞周期不固定,不统一,难以区别对待而使得骨髓染色体分裂指数低,染色体短粗,分散度差,且成本较高。[0006]因此,建立一种具有分裂相多、分散度好、带纹清晰、长度适中等特征的骨髓G带制作方法尤为重要。[0007]【发明内容】[0008]本发明的目的是克服现有技术的缺陷,提供一种骨髓染色体提取试剂盒,所述试剂盒包括试剂1、试剂2、试剂3和试剂4组成的液体型试剂,其中试剂I的各组分及浓度范围为:基础培养基为RPMI1640,所述的各添加成分用量为:青霉素/链霉素5-15ul/ml胎牛血清60-140ul/ml人类淋巴瘤细胞培养物60-140ul/ml试剂2的成分及浓度范围为:~:秋水仙***8~15μg/ml试剂4的成分及浓度范围为:***化钾(λ050~,所述试剂I的各组分及浓度范围为:基础培养基RPMI1640,所述的各添加成分用量为:青霉素/链霉素8-12ul/ml胎牛血清80-120ul/ml人类淋巴瘤细胞培养物80-120ul/ml所述试剂2的成分及浓度范围为:~:秋水仙***10~13μg/ml所述试剂4的成分及浓度范围为:***~,所述试剂I的各组分及浓度范围为:基础培养基RPMI1640,所述的各添加成分用量为:青霉素/链霉素8ul/ml胎牛血清96ul/ml人类淋巴瘤细胞培养物96ul/ml所述试剂2的成分及浓度范围为:溴化乙锭3mg/ml所述试剂3的成分及浓度范围为:秋水仙***12μg/ml所述试剂4的成分及浓度范围为:***,所述的配制培养基的青霉素和链霉素浓度分别为10000U/ml和10000μg/mlο[0009]进一步地,试剂1、试剂2、试剂3和试剂4保存温度为2~8°C。[0010]本发明的有益效果是:一、本发明在传统的骨髓培养基中加入了人类淋巴瘤细胞培养物,该培养物可以为骨髓细胞提供更多的营养物,包括生长因子等,因而培养出的细胞制取出的G带背景更加清晰、骨髓染色体分裂相多、形态及分散度更加良好。[0011]二、终止细胞培养时加入一定量的溴化乙锭可以使染色体长度增加,带纹更加清晰。【专利附图】【附图说明】[0012]图1是实验组I骨髓染色体G带显色的镜下G带图谱。[0013]图2是实验组2骨髓染色体G带显色的镜下G带图谱。[0014]图3是实验组3骨髓染色体G带显色的镜下G带图谱。[0015]图4是对照组I骨髓染色体G带显色的镜下G带图谱。[0016]图5是2000例骨髓样品各种病例所占比率。[0017]图6是分别利用本发明方法(实验组4)和现有技术(对照组2)方法,对2000例骨髓样品进行G带显色,镜下观察能达到20个良好分裂相的检测结果。[0018]图7是分别利用本发明方法(实验组4)和现有技术(对照组2)方法,对2000例骨髓样品进行G带显色,异常染色体检测结果。[0019]图8是分别利用本发明方法(实验组4)和现有技术(对照组2)方法,对其中一例病例(随机抽取)进行G带显色的镜下G带图谱对照。其中A系列是本发明方法,B系列是对照组方法。[0020]【具体实施方式】[0021]下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。[0022]实施例1配制骨髓细胞培养基在基础培养基中添加了青霉素/链霉素,胎牛血清和人类淋巴瘤细胞培养物。其中基础培养基为RPMI1640培养基。[0023]所述各添加成分的用量如下:青霉素/链霉素5-15ul/ml胎牛血清60-140ul/ml人类淋巴瘤细胞培养物60-140ul/ml其中,青霉素可选自10000U/ml`,链霉素可选自10000yg/ml。在其它实施方式中,可选自其它浓度青霉素和链霉素用于配制培养基。[0024]其中,人类淋巴瘤细胞培养物可以按现有的各种方法获得或制备,在本实施例中,按以下方法制取:细胞经复苏和传代,当传代细胞培养基颜色变为黄色时,收集细胞并离心,离心后,收集上清并过滤得细胞培养物。[0025]更具体的制取人类淋巴瘤细胞培养物的方法包括以下步骤:,紫外线照射30分钟。[0026],立即放入37°C水浴摇动促其内容物2分钟内迅速融化。[0027]%胎牛血清RPM1-1640培养基中,37°C,5%C02培养。[0028]%的融合率时,加入4ml的胰蛋白酶(含EDTA),确保细胞培养瓶底部覆盖一薄层胰蛋白酶。[0029],镜检,如果所有细胞都已脱落,加入IOml的培养基,并用移液管将细胞冲散。[0030],将细胞悬液一传四,转入含有IOml培养基的细胞培养瓶中,温和地混匀细胞。[0031](拧松瓶盖),当细胞密度达到大约50%融合率时,更换培养基,至终浓度40ml左右。[0032]。用血清移液管将培养好的细胞转入50ml圆底聚丙乙烯离心管中(贴上相应标签),2000rpm离心lOmin。[0033],(收集时切勿碰到细胞沉淀),即为人类淋巴瘤细胞培养物。如果不使用可将过滤后的培养物储存于_20°C。[0034]实施例2骨髓染色体提取试剂盒骨髓染色体提取试剂盒包括试剂1、试剂2、试剂3和试剂4组成的液体型试剂。[0035]其中试剂I为骨髓细胞培养基,按实施例1所述方法配制,试剂I包括基础培养基和各添加成分,所述的各添加成分用量为:青霉素/链霉素5-15ul/ml胎牛血清60-140ul/ml人类淋巴瘤细胞培养物60-140ul/ml优选的,试剂I包括基础培养基和各添加成分,所述的各添加成分用量为:青霉素/链霉素7-12ul/ml胎牛血清80-120ul/ml人类淋巴瘤细胞培养物80-120ul/ml更优选的,试剂I包括基础培养基和各添加成分,所述的各添加成分用量为:青霉素/链霉素8ul/ml胎牛血清96ul/ml人类淋巴瘤细胞培养物96ul/ml其中,所述的基础培养基可以为RPMI1640培养基。[0036]试剂2的成分及浓度范围为:~。[0037]优选的,~。[0038]更优选的,溴化乙锭的浓度为3mg/ml。[0039]其中所述溴化乙锭的配制方法可以采用本实施例所述的方法,也可以采用本领域其他的方法配制。[0040]A配制溴化乙锭(EB)(浓度为9mg/ml),磁力搅拌数小时以确保其完全溶解,然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中,保存于室温。[0041](浓度为3mg/ml)储藏液以1:2(EBiddH2O)的比例稀释成浓度为3mg/ml的工作液。[0042]试剂3的成分及浓度范围为:秋水仙***8~15yg/ml。[0043]优选的,秋水仙***的浓度为10~13μg/ml。[0044]更优选的,秋水仙***的浓度为12μg/ml。[0045]其中所述秋水仙***的配制方法可以采用本实施例所述的方法,也可以采用本领域其它的方法配制。[0046]B配制秋水仙***(浓度为120μg/ml)称取12mg秋水仙***,,待完全溶解后,(81bf/in2)15min高压蒸汽灭菌后避光保存于4°C冰箱中。[0047](浓度为12yg/ml)取120μg/ml秋水仙******。[0048]试剂4的成分及浓度范围为:***~[0049]优选的,***~。[0050]更优选的,***。[0051]实施例3骨髓细胞培养及染色体标本的制备本实施例按如下方法培养骨髓细胞及染色体制片。在其它实施方式中,也可采用其它方法培养骨髓细胞和染色体制片。本实施例所述方法为:(O配置骨髓培养基:按实施例1的方法配制;(2)接种:将骨髓细胞接种到步骤I所述的培养基中;(3)终止培养;(4)收取骨髓细胞培养物,用于染色体制片;(5)染色体标本制片:利用染料染色后获得具有G显带的染色体标本。[0052]培养骨髓细胞和染色体提取所需的培养基和试剂可以选用本实施例2所述的骨髓染色体提取试剂盒,也可以按实施例1和实施例2中所述的方法自行配制。[0053]其中步骤2接种可以采用将骨髓细胞以I~3XIO6个/ml的密度接种到骨髓培养基中,放入37°C,%C02培养箱培养24小时。还可以采用其它适合骨髓细胞生长的方式选择接种的密度和培养条件。[0054]其中步骤3终止培养中,每个培养瓶(含5ml骨髓培养基)中加入一定量的溴化乙锭(例如试剂盒中的试剂2)和秋水仙***(例如试剂盒中的试剂3),摇晃均匀后37°C,%培养箱孵育I小时。[0055]其中步骤4收取骨髓细胞培养物可按如下方法收集,也可按本领域常用的其它方法收集。