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饲料产品中黄曲霉毒素的解毒的制作方法.docx


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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。饲料产品中黄曲霉***的解毒的制作方法专利名称:饲料产品中黄曲霉***的解毒的制作方法技术领域:本发明涉及解毒受到真菌***黄曲霉***(mycotoxinaflatoxin)污染的饲料产物的方法。背景技术:黄曲霉***是天然存在的真菌***,其由曲霉属多个种,特别是黄曲霉(Aspergillusflavus)禾口寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)产生。黄曲霉***有毒并致癌。曲霉属的产生黄曲霉***的成员在自然界是常见的和广泛的。它们可在收获前或储藏过程中在谷物上形成菌落并污染谷物。宿主作物在长期暴露于高湿度环境后或在由应激条件,如干旱(其为降低了进入的障碍的条件)造成损伤后,特别易受曲霉属的感染,经常受影响的作物包括谷类,如玉米(maize)、高粱(sorghum)、黍(millet)、稻(rice)和小麦(wheat),以及油籽(oilseeds),如油菜(rape)、花生(peanut)、大豆(soybean)、向曰葵(sunflower)禾口棉花(cotton)。当在乙醇产生中使用谷粒和消耗淀粉时,黄曲霉***在发酵副产物中,例如,在用作饲料产物的蒸馏干酒糟(distillers’driedgrain)中富集,且在发酵副产物中黄曲霉***可相对于在谷粒中增加为三倍。因此,受黄曲霉***污染的蒸馏酒糟(distillers'grain)可对消耗这些产物的动物的安全造成风险,而且随着蒸馏酒糟在乳牛饲料中的广泛应用,还存在由于牛奶中的黄曲霉***残余物导致潜在的对人类安全的担忧。使用微生物使黄曲霉***失活公开于W02006053357。酶法灭活其他真菌***公开于W09612414。需要对受真菌***黄曲霉***污染的动物饲料,如发酵副产物,包括湿和干的蒸馏酒糟(distillers’wetanddriedgrain)进行解毒的其它方法。发明内容在第一个方面,本发明提供了从植物材料产生饲料产物的方法,所述方法包括用降解黄曲霉***的酶处理所述植物材料,以产生黄曲霉***水平降低的饲料产物。在第二个方面,本发明提供了在植物材料中降解黄曲霉***的方法,该方法包括用酶处理所述植物材料。在第三个方面,本发明提供了酶用于降解黄曲霉***的用途。所述酶优选选自下组漆酶、角质酶和羧肽酶(carboxyp印tidase)。发明详述黄曲霉***在本发明的语境中,术语“黄曲霉***”包括任何类型的黄曲霉***。术语“黄曲霉***”还包括黄曲霉***的任何衍生物,其对于酶(例如漆酶、角质酶或羧肽酶)的修饰是易感的(susceptible)。在自然界中产生了至少13中不同类型的黄曲霉***。被认为是最毒的黄曲霉***Bi,以及B2由黄曲霄(Aspergillusflavus)禾口寄生曲霄(Aspergillusparasiticus)两者产生。黄曲霉***Gl和G2仅完全由寄生曲霉产生。黄曲霉***Ml和M2起初在以发霉谷粒饲养的母牛所产的奶中发现。这些化合物是动物肝脏中转换过程的产物。然而,黄曲霉***Ml亦存在于寄生曲霉的发酵液中。虽然在饲料产物中存在曲霉属并非总是表明还存在有害水平的黄曲霉***,但其确实暗示食用该产物具有显著的风险。棺物材料植物材料可包括谷类,例如,玉米(corn)、小麦、大麦、黑麦、稻、高粱和黍中的一种或多种;豆类,例如大豆、豌豆和花生中的一种或多种;油籽,例如,油菜、大豆、向日葵和棉花。所述植物材料可经磨制,例如,湿磨或干磨的谷粒,包括含有谷蛋白/面筋(gluten)、蛋白质、淀粉、糠(bran)和/或油的磨制级分。所述植物材料可为除具有不受欢迎水平(unwantedlevel)的黄曲霉***外适于产生动物饲料产物的植物材料。所述植物材料亦可为怀疑其包含不受欢迎水平的黄曲霉***的植物材料,和/或具有未知水平黄曲霉***的植物材料,其中包括未包含可检测水平黄曲霉***的植物材料。本发明的方法可与如下的任何方法组合,该方法中产生适合作为动物饲料产物的产物,或者作为主产物,或者作为副产物。因此本发明的植物材料可为用于产生发酵产物的方法的醪液(mash)。所述发酵产物优选为乙醇产物,例如,啤酒、饮用乙醇、燃料乙醇和/或工业乙醇。本发明的方法可在发酵步骤之前,过程中或之后实施,其目的为降解醪液中包含的存在于植物材料中的黄曲霉***,以产生黄曲霉***量减少的产物,例如,酒糟(spendgrain)或者湿或干的蒸馏酒糟。类似的,本发明的植物材料可为在湿磨方法中的浸渍步骤中的谷粒,在所述方法亦产生适合作为动物饲料产物的产物。植物材料可为除具有不受欢迎水平或未知水平的黄曲霉***之外,适于动物食用的材料,即,根据如下定义的动物饲料产物。动物饲料产物术语“动物”包括所有动物,包括人。动物的实例是牛(cattle),(包括但不限于乳牛/母牛(cow)和小牛(calf));单胃动物,例如猪(pigorswine)(包括,但不限于,小猪(piglet)、饲育猪(growingpig)和母猪(sow));家禽如火鸡(turkey)和鸡(chicken)(包括但不限于雏鸡(broilerchick)、蛋鸡(layer));和鱼(包括但不限于鲑鱼(salmon))。术语“饲料”或“饲料产物”意指任何适于或意图用于由动物摄取的化合物、制备物、混合物或组合物。所述饲料产物可以是除具有不受欢迎水平的黄曲霉***外适合于由动物食用(consumption)的产物。所述饲料产物也可以是怀疑其包含不受欢迎水平的黄曲霉***的产物和/或具有未知水平黄曲霉***的产物,其中包括未包含可检测水平黄曲霉***的产物。所述饲料产物优选包含谷类,例如,玉米、小麦、大麦、黑麦、稻、高粱和黍中的一种或多种;豆类,例如,大豆、豌豆和花生中的一种或多种;油籽,例如,油菜、大豆、向日葵和棉花。所述饲料产物可经磨制,例如,湿磨或干磨的谷粒,包括含有谷蛋白/面筋、蛋白质、淀粉、糠和/或油的磨制级分。Mfi在本发明的语境中,术语“漆酶”。优选的是下述的酶以及具有同源序列的酶,特别是重组的和/或基本上纯化的酶。所述漆酶可源自任何来源,优选来自微生物,如真菌或细菌。优选地,所用的漆酶源自多孔菌属菌种(Polyporussp.)的菌株,特别是Polyporuspinisitus或杂色多孔菌(Polyporusversicolor)的菌株,或毁丝霉属菌种(Myceliophtherasp·),例如嗜热毁丝霉(Mthermophila)的菌株,或丝核菌属菌种(Rhizoctoniasp.)的菌株,特别是Rhizoctoniapraticola或立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)的菌株,或盐肤木属物种(Rhussp·),特别是木蜡树(Rhusvernicifera)的株。在本发明的具体实施方案中,氧化还原酶是WO96/00290中描述的Polyporuspinisitus漆酶(也称长绒毛栓菌(Trametesvillosa)漆酶)、W095/33836中描述的嗜热毁丝霉漆酶,或者具有与这些序列中任一同源的氨基酸序列的漆酶。进一步,漆酶可以是柱顶孢属菌种(Scytalidiumsp.)漆酶,如WO95/33837中描述的嗜热柱顶孢()漆酶,或梨孢属菌种(Pyriculariasp.)漆酶,(Pyriculariaoryzae)漆酶,或鬼伞属菌种(Coprinussp.)漆酶,如灰盖鬼伞()漆酶,特别是灰盖鬼伞IFO30116漆酶,或丝核菌属菌种漆酶,如立枯丝核菌漆酶,特别是WO95/07988中描述的中性立枯丝核菌漆酶。在优选的实施方案中,漆酶是来自嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)(MtL)的、具有作为GENESEQP:AAR88500保藏并在本文显示为SEQIDNO3的氨基酸序列的漆酶,来自Polyporuspinsitus(PpL)的、具有作为UNIPR0T:Q99044保藏并在本文显示为SEQIDNO:4的氨基酸序列的漆酶,来自天蓝色链霉菌(Sti^ptomycescoelicolor)ScL的、具有作为SWISSPROT:Q9XAL8保藏并在本文显示为SEQIDNO5的氨基酸序列的漆酶,或具有与这些序列中的任一同源的氨基酸序列的漆酶。漆酶必需以有效量存在于要解毒的介质中。-IOOmg酶蛋白每kg干物质,-IOmg酶蛋白每kg干物质,或更优选l_5mg酶蛋白每kg干物质的浓度存在。介体(mediator)在施用漆酶的一个实施方案中,充当电子的介体可与漆酶一起使用。所述介体应该以有效量存在于要解毒的介质中。已知多种介体;参见例如W09412620、W09412621、W09501626、W09600179和W09923887。将其中的介体通过提述并入本文。优选用于本发明的是选自以下的介体丁香酸甲酯(methylsyringate)(MES)、吩噻嗪-10-丙酸(phenothiazine-10-propionicacid)(PPT)、η-(4-***基苯基)乙酰氧厢酸(n-(4-cyanophenyl)acetohydroxamicacid)(NCPA)、乙酉先丁香***(acetosyringone)、丁5香醛(syringaldehyde)、对香豆酸(p-coumaricacid),2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate))、1_羟基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole)>2,4-戊二***和吩噻嗪。所述介体是商业上可得到的或能够通过本领域已知方法制备的。角质酶在本发明的语境下,术语“角质酶”。优选的是下面提及的酶以及具有同源序列的酶,特别是重组的和/或基本上纯化的酶。所述角质酶可来自微生物,优选来自真菌或细菌。具体而言,所述角质酶可来自腐质霉属(Humicola),特别是特异腐质霉()的菌株,更具体为特异腐质霉菌株DSM1800(US5,827,719),或来自镰孢属(Fusarium),例如,大刀粉红镰孢(),或具体为腐皮镰孢豌豆专化型()的菌株(W090/09446;W094/14964,W094/03578)。所述真菌角质酶亦可源自丝核菌属的菌株,例如,立枯丝核菌(),或链格孢属(Alternaria)的菌株,例如,芸薹生链格孢()(W094/03578)。优选的是示于SEQIDNO=I的角质酶;特异腐质霉角质酶(对应于US5,827,719中SEQIDNO2的成熟部分,以及W01/92502的SEQIDNO1的成熟部分),以及示于SEQIDNO2的角质酶;根据WO94/14964图ID的腐皮镰孢豌豆专化型,以及具有与这些序列中的任一同源的氨基酸序列的漆酶。所述角质酶亦可为亲本角质酶的变体,如描述于WO00/34450或W001/92502中的那些,其全部通过提述并入本文。所述角质酶可为包含下述取代的特异腐质霉角质酶E6Q、G8D、A14P、N15D、E47K、S48E、R51P、A88H、A91H、A130V、E179Q和R189V,其在WO2001/092502的24页11行中公开,并用于本文的实施例1。所述角质酶必须以有效量存在于要解毒的介质中。-IOOmg酶蛋白质每kg干物质,-IOmg酶蛋白质每kg干物质,或更优选l_5mg酶蛋白质每kg干物质的浓度存在。羧肽酶在本发明的语境下,术语“羧肽酶“指剪切肽或多肽链C-末端肽键的酶。,丝氨酸型羧肽酶的酶。优选的是下面提及的酶,特别是重组和/或基本上纯化的酶。所述羧肽酶可源自任何来源,优选来自微生物,如真菌或细菌。在优选实施方案中,所述羧肽酶源自米曲霉,优选如SEQIDNO5和SEQIDNO6中所示的羧肽酶。所述羧肽酶必须以有效量存在于要解毒的介质中。-IOOmg酶蛋白质,-IOmg酶蛋白质,或更优选每kg干物质l-5mg酶蛋白质的浓度存在。介质(medium)在一个实施方案中,酶降解包含饲料产物的介质中的黄曲霉***。所述介质优选是水性的并且可以是液体、糊剂(paste)或浆。为了形成合适的介质,可以向饲料产物加入水。酶以及(如果有关的话)介体可以分别或一起包含在适合施用于所述介质的固态或液态配制物中。本发明的解毒效力依赖于例如介质的氧的可用性、pH、温度和缓冲液。例如,可以在实际酶的相对活性为至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或甚至至少90%的pH值进行处理。同样,例如,可以在实际酶的相对活性为至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或甚至至少90%的温度进行处理。相对活性是相对于观察到最高活性的pH值的活性计算的。介质中的氧当使用漆酶时,所需的氧的来源可以是来自大气的氧或用于原位产生氧的氧前体。来自大气的氧会通常以充足的量存在。如果需要更多的02,可以加入额外的氧,例如,作为加压的大气或作为加压的纯氧。介质中的DH依赖于所采用的酶的特征及其他因素,所用介质的PH应通常在5-11的范围内,优选在6-10的范围内,-。介质中的温度优选使用接近于用于酶的最适温度的反应温度。在本发明的多个实施方案中,应使用10-65°C,更优选30-50°C范围内的温度。处理持续时间处理的持续时间依赖于处理类型、要处理的产物(item)的类型、介质的性质(例如温度和PH)和所用的酶的类型和量等。酶反应持续进行直到达到期望的结果,其后可以或可以不通过使酶失活(例如,通过热处理步骤)终止所述酶反应。为了解毒的目的,可以使用范围在1分钟至1周的处理时间。在许多情况下,6-48小时范围内的处理时间是合适的。通过本发明的方法,饲料产物中黄曲霉***的含量相对于采用该方法之前的水平优选减少到少于90%、少于80%、少于70%、少于60%、少于50%、少于40%、少于30%、少于20%、少于15%、少于10%或甚至少于5%,如少于4、3、2或甚至1%。同一性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联性用参数“同一性”描述。就本发明而言,两个氨基酸序列之间的同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,ics16:276_277)()的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,-453)来确定的。所用的任选参数是缺口产生罚分(gapopenpenalty)为10,缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)为0·5,和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记为“longestidentity"(“最长同一性”)的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并且该输出结果是如下计算的(相同的残基数χ100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)就本发明而言,两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度是使用如

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