靶向改变dna的制作方法.docx

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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。靶向改变dna的制作方法靶向改变dna的制作方法本发明涉及靶向改变受体DNA,例如双链受体DNA的方法。该方法包括寡核苷酸的应用,该寡核苷酸具有至少一个相对靶(双链)受体DNA的错配。该错配位于所述寡核苷酸中的特定位点。还提供了一种包含用于实施本发明方法的说明书的试剂盒,在一个优选实施方式中,包含适用于该方法的寡核苷酸。【专利说明】靶向改变DNA【技术领域】[0001]本发明涉及靶向改变受体DNA,例如双链受体DNA的方法。所述方法包括寡核苷酸的应用,该寡核苷酸有至少ー个相对靶(双链)受体DNA的错配。错配位于所述的寡核苷酸的特定位置上。本发明同时提供了包括实施本发明方法的说明书,且在优选的实施方式中包括本方法适用的寡核苷酸。【背景技术】[0002]遗传修饰是在活细胞的遗传物质中特意形成变化的方法。该目的通常是修饰细胞,或细胞形成的部分生物体或细胞可再生成的生物体的遗传编码生物特性。这些改变可采用以下方式:删除部分遗传物质、添加外源性遗传物质或改变遗传物质中存在的核苷酸序列,例如用一个核苷酸取代另ー个核苷酸。[0003]已经有20多年知道遗传修饰真核生物的方法,并发现已广泛应用于植物、人和动物细胞以及微生物以改善农业、人类健康、食物品质和环境保护领域。[0004]常见的遗传修饰方法由以下方法组成:向细胞基因组添加外源DN***段,这可能赋予该细胞或其生物体ー种新特性,该特性超过并优于已存在基因所编码的特性(包括从而抑制已存在基因表达的应用)。[0005]虽然这些方法在向靶标提供所需特性上可能有一定功效,但这些方法并不精确。例如,无法控制外源DN***段插入的基因组位点(进而控制最终表达水平)。另外,所需效果的自身体现必需超过原始和良好平衡基因组所编码的天然性质。相反,遗传修饰方法会导致预定基因组基因座中核苷酸的増加、缺失或转化,从而精确并可控地修饰现有基因。[0006]寡核苷酸导向的靶向核苷酸交換(TNE)是ー种基于向真核细胞递送(合成)寡核苷酸(由沃森-克里克碱基配对性质类似于DNA但化学上不同于DNA的核苷酸和/或核苷酸样部分的短链组成的分子;(Alexeev和Yoon,1998);(Rice等,2001);(Kmiec,2003))的方法。[0007]通过在寡核苷酸的同源序列上特意设计错配核苷酸,该错配核苷酸可能诱导改变可与其核苷酸杂交的基因组DNA序列。该方法允许转化靶标中一个或多个核苷酸,并且可(例如)应用在现有基因中产生终止密码子导致其功能破坏,或产生密码子改变导致基因编码蛋白具有改变的氨基酸组成(蛋白质工程)。[0008]靶向核苷酸交換(TNE)已经在包括植物、动物和酵母细胞的许多生物体中描述,也称为寡核苷酸导向诱变(ODM)。[0009]TNE的第一个示例使用来自动物细胞的嵌合DNA=RNA寡核苷酸(综述见(Igoucheva等,2001))。使用嵌合DNA:RNA寡核苷酸的TNE也在植物细胞中证实(Beetham等,1999;Kochevenko和Willmitzer,2003;Okuzaki和Toriyama,2004;Zhu等,2000;Zhu等,1999)。通常在非选择性染色体基因座上实际应用TNE时,植物和动物研究中报告的频率都太低,。发现使用嵌合寡核苷酸的TNE也难以重复(Ruiter等,2003),从而需要寻找其它寡核苷酸设计以产生更可靠的結果。[0010]多个实验室已聚焦于在TNE中使用单链(SS)寡核苷酸。已发现其在植物和动物细胞中提供了更多可重复的结果(Liu等,2002)(Parekh-Olmedo等,2005)(Dong等,2006)。然而,在细胞,特别是较高等生物体(如植物)的细胞中使用TNE所面临的最大问题还是迄今为止报道的效率相对较低。在玉米中,报道的转化频率为lxl0_4(Zhu等,2000)。在烟草(Kochevenko和Willmitzer,2003)和水稻(Okuzaki和Toriyama,2004)中的后续实验中报道的频率分别是IxlO-6和1x10'[0011]使用各类寡核苷酸的TNE已是各种专利和专利申请的主题,包括US6936467、US7226785、US579597、US6136601、US2003/0163849、US2003/0236208、W003/013226、US5594121和W001/92512。[0012]在US6936467中认为,使用未修饰DNA寡核苷酸得到低基因改变频率是由于反应混合物或靶细胞中存在的核酸酶降解了供体寡核苷酸。提出引入修饰的核苷酸,其使所得的寡核苷酸(更)耐核酸酶。公开这些修饰优选位于寡核苷酸末端,其中错配存在于距离各末端至少8个核苷酸。[0013]US7226785也掲示了用具有至少ー个修饰的耐核酸末端区域的修饰单链寡核苷酸来靶向染色体基因组改变的方法。使用修饰的单链寡核苷酸的TNE也是W002/26967的主题。[0014]因为现有TNE方法效率低,需要替代和/或更好的TNE技木。这些技术可单独使用或与上述和本【技术领域】的现有TNE技术联用以改善效率。因此,本发明人表明了对现有TNE技术的改进。【发明内容】[0015]技术问题[0016]本领域确定的技术问题是现有在细胞中诱导特定或需要的遗传变化的可用方法,例如在植物细胞中存在的基因组中导入特定的遗传变化,由于受到低效的阻碍,使该技术费カ并且昂贵。需要替代的且更佳的TNE技木。[0017]需要解决的问题之ー是提供一种替代的和/或更佳的和/或额外的方法以将遗传变化引入遗传信息,例如(如存在于细胞中的)双链DNA序列。优选该方法与本【技术领域】描述那些方法相比改善了效率。这些方法能向细胞提供改变的遗传信息,特别是就通过向靶DNA导入该改变从而改变该细胞功能的细胞而言。例如这些功能可涉及DNA序列编码蛋白的特性改变,该DNA序列包含根据本发明方法改变的DNA。[0018]问题的解决方案[0019]发明人发现ー种靶向改变双链DNA序列的方法。该方法使用包含能与靶标杂交的结构域的供体寡核苷酸(如本领域技术人员已知,在允许杂交的条件下)。该供体寡核苷酸还包括相比靶双链DNA序列的至少ー个错配,该错配导入到靶双链DNA序列中。[0020]而本【技术领域】和常规知识主张错配应该存在于寡核苷酸中,換言之,寡核苷酸“中间某个位点”(參见例如,如上所述的各种专利申请,特别是US6936467和US7226785),现在出人意料且非预期地发现当错配不位于寡核苷酸中间某位点而在特定位置时TNE效率良好。尤其发现对于有效的TNE而言,错配位于距离寡核苷酸3’端最多2个核苷酸,优选最多I个核苷酸的位置。最优选至少ー个错配位于(单链)寡核苷酸的3’末端。[0021]与通常认为错配应该位于寡核苷酸中间部分,以及例如导入寡核苷酸5’末端和3’末端的修饰应该是防止核酸酶过早降解该寡核苷酸(參见例如US6936467)相反,现在发现在寡核苷酸距离3’末端0,I或2个核苷酸处的错配可有利地用于靶核苷酸交換,即靶向改变双链DNA序列的方法。[0022]此外,包含至少ー个距离3’末端0,I或最多2个核苷酸的错配的寡核苷酸可通过纳入修饰核苷酸进ー步修饰,即该修饰核苷酸具有碱基修饰、主链修饰、糖修饰和/或在所述核苷酸5’末端和/或3’末端进行修饰的核苷酸。这些修饰包括熟知的修饰,以改善寡核苷酸与靶序列的结合/杂交和/或防止或抑制所谓核酸酶分解寡核苷酸。该修饰核苷酸的示例包括锁核酸,或具有硫代磷酸酯键的核苷酸。然而,如实施例3所示,不要求寡核苷酸引入具有硫代磷酸酯键的核苷酸也不要求寡核苷酸引入任何其它类型的修饰核苷酸。[0023]附图简要说明[0024]图1显示含有一个终止密码子的GFP开放阅读框核苷酸序列(SEQIDNO:1)。[0025]图2显示GFP-终止蛋白的氨基酸序列,其终止密码子位点用星号表示(SEQIDN0:2)。[0026]图3显示用于本研究的构建体示意性概图。[0027]图4显示通过不同寡核苷酸的附加体GFP修复,其在至少3个独立实验中测试。[0028]图5显示YFP-终止构建体的核苷酸序列。位于186的核苷酸已经改变(C到A),产生了ー个框内的终止密码子(SEQIDNO:3)。[0029]图6显示YFP-终止的蛋白序列。蛋白中的终止密码子的位点用星号表示(SEQIDN0:4)。[0030]图7显示番茄原生质体中附加体YFP质粒上的TNE。7460表示仅使用野生型YFP基因的转化效率。7461+PB212表示35SYFP-终止构建体与寡核苷酸PB212—起共同导入番茄原生质体的修复效率。[0031]图8显示本发明的寡核苷酸甚至在没有例如PS连接的任何修饰下提高了TNE效率。[0032]定义[0033]以下说明和实施例中使用了许多术语。为提供对说明书和权利要求清楚和一致的理解,包括给定这些术语的范围,提供以下定义。除非另外定义,使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。所有出版物、专利申请、专利和其他文献的公开内容都在本文中完整引入以供參考。[0034]如本文所用,単数形式的“ー个”、“ー种”和“该”包括复数指代形式,除非文中另有明确说明。例如,分离“ー个"DNA分子的方法,如上所用,包括分离多个分子(例如,上十、上百、上千、上万、上十万、上百万或更多的分子)。[0035]用于本发明方法的常规技术的实施方法对本领域技术人员是显而易见的。分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、测序和相关领域中的常规技术的实践对于本领域技术人员而言是熟知的,并描述在(例如)以下參考文献中:Sambrook等,MolecularCloning(《分子克隆:实验室手册'》),第二版,冷泉港出版社,冷泉港,纽约,1989;Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology(《新编分子生物学实验指南》),约翰威力和桑斯有限公司(JohnWiley&Sons),纽约,1987及定期更新;和MethodsinEnzymology(《酶学方法》)系列,学术出版社(AcademicPress),圣地亚哥。[0036]本发明的核酸可包括嘧啶和嘌呤碱基,分别优选胞嘧啶、胸腺嘧啶、和尿嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤的任何聚合物或寡聚物(,PrinciplesofBiochemistry(《生物化学原理》),793-800()其在此出于所有目的完整引入以供參考)。本发明考虑了任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸成分,以及任何其化学变体,例如这些碱基的***化、羟***化或糖基化形式等。在组合物中聚合物或寡聚物可以是异源或同源的,可分离自天然存在的来源,或者人工或合成产生。另外,核酸可以是DNA或RNA,或其混合物,可永久或瞬间以单链或双链形式,存在,包括同源双链、异源双链、和杂交状态。[0037](合成)寡核苷酸:可化学合成的具有优选约5-150个碱基的单链DNA分子被称为合成寡核苷酸。一般这些合成DNA分子设计成具有独特或所需的核苷酸序列,虽然可能合成具有相关序列的分子家族,其在核苷酸序列内的特定位点具有不同核苷酸组成。术语合成寡核苷酸用于指具有经设计或所需核苷酸序列的DNA分子。[0038]“靶向核苷酸交換”或“TNE”。靶向核苷酸交換(TNE)是ー种方法,通过该方法一条与染色体或附加体基因中的位点至少部分互补的合成寡核苷酸引导逆转特异性位点核苷酸的方法。TNE经描述使用了大量寡核苷酸和祀标。一些报道的寡核苷酸是RNA/DNA嵌合体,包含末端修饰以具有核酸酶耐受性。【具体实施方式】[0039]本发明一方面涉及靶向改变双链受体DNA序列的方法。[0040]该方法包括将ー个/该双链受体DNA序列与供体寡核苷酸结合。该寡核苷酸包含能与第一DNA序列杂交的结构域(在如本领域技术人员知晓的杂交条件下)。能与第一DNA序列杂交的结构域包含至少ー个相对第一DNA序列的错配。所述至少一个错配位于距离所述第一寡核苷酸3’末端最多2个,优选最多I个核苷酸处。最优选所述至少ー个错配位于该寡核苷酸的3’末端。[0041]本发明方法能通过寡核苷酸的方式特异性和选择性改变受体DNA序列中特异性位点的一个或多个核苷酸。特别是可以根据本发明(即相比第一DNA序列具有至少ー个错配,其中至少ー个错配位于距离所述寡核苷酸3’端最多2个优选最多I个核苷酸处)通过向该细胞引入寡核苷酸在含有双链受体DNA序列的靶细胞中实施靶向改变。最优选所述至少ー个错配位于寡核苷酸的3’末端。该方法的结果是靶向改变ー个或多个核苷酸,因而改变靶DNA序列。本发明可优选体内实施,但也可以离体或体外实施。[0042]在本发明的范围中,双链DNA序列包含第一DNA序列和第二DNA序列。第二DNA序列与第一DNA序列互补并与之配对形成双链。例如,第一DNA序列ATTT(方向从5’到3’)的互补是TAAA(方向从3’到5’)。第二DNA序列与第一DNA序列配对形成双链。例如,在双链DNA序列是ー个基因的一部分的情况下,第一DNA序列可在有义链或反义链上。[0043]双链DNA序列的DNA可以是任意类型的DNA,如基因组DNA、衍生自基因组的DNA、线性DNA、人工染色体、核染色体DNA、细胞器DNA、BAC、YAC、质粒DNA、或附加体DNA。DNA序列可以是内含子或外显子的部分,编码或非编码的,调控或不调控表达的。[0044]用于本发明所述方法的寡核苷酸优选单链并包含至少ー个能与第一DNA序列杂交的结构域。[0045]相对待改变的双链DNA序列的至少ー个错配位于距离该寡核苷酸3’末端O、I或2个核苷酸处,该错配包含在能与第一