具有高抗性淀粉低直链淀粉的水稻种质的培育方法.docx

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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。具有高抗性淀粉低直链淀粉的水稻种质的培育方法专利名称:具有高抗性淀粉低直链淀粉的水稻种质的培育方法技术领域:本发明涉及生物技术领域,尤其是通过常规育种、生物技术育种以及功能成分的生理鉴定等有机结合,培育一种融合高抗性淀粉的优良食味品质水稻的育种方法。背景技术:抗性淀粉(RS)又称为抗酶性淀粉和抗消化淀粉。研究表明,在小肠内,RS不能被消化吸收和提供葡萄糖,在大肠可被生理性细菌发酵,产生短链脂肪酸和气体。RS在代谢特性上类似于膳食纤维,通过降低糖尿病患者饭后血糖值、控制体重、有效防止肠道疾病及降血脂等功效,从而降低一些慢性病(如糖尿病、大肠癌及肥胖等)的发病风险,并对防便秘、盲肠炎和痔疮也有重要的预防作用(RobertsoDM,BickertonAS,LouiseDA,,2005,82(3):559-567;MoritaT,HayashiJ,MotoiH,,70S:179-185;LeLeuRK,HuY,;DigestiveDiseaseWeekandthe102ndAnnualMeetingoftheAmericanGastroenterologicalAssociation[C],2001,20(5):A667;BirkettAM,MathersJC,JonesGP,etalBrJNutr2000,84:63-72)。RS研究开发最初是通过物理化学方法(压热、微波辐射、脱支等)从淀粉原料中制备RS产品(徐丹鸿,,2005,4:9-11),但是这种加工方法,成本高,得到的RS产品价格昂贵。目前国外开展的RS产品研究,多是以玉米、小麦和土豆作为原料,而利用水稻作为RS产品原料的并不多,究其原因是由于水稻虽然含70%-80%的淀粉,在3大粮食作物中淀粉含量最高,但稻米中RS含量很低,热米饭中RS含量一般低于1,%(,1999,(2):3-6),特别对于以优质和高产为育种目标的主推良种,RS就更低。因此,筛选高RS水稻资源是丰富RS原料的有效途径。目前有关水稻资源筛选RS的工作已经开展,研究表明:高RS水稻资源多来自云南,但是高RS的特色资源多是直链淀粉含量也比较高的籼稻,直链淀粉含量高达20%以上,不仅口感差,表现为垩白率较高、食味品质和蒸煮品质欠佳等严重地影响大米的品质的形状,而且多是农家种,产量潜力很低,多为亩产IOOkg/亩,(王艳平,李华勇,方先文,林静,不同来源水稻种质的直链淀粉含量多样性分析,金陵科技学院学报,2010,26(3):39-42),而且由于RS含量测定的费用较高,批量筛选RS的工作需要大量经费支持,这些已经筛选出的高RS的农家种或地方品种,与现代主产水稻品种中,平均亩产500kg的产量相t匕,尤其亩产800kg的超级稻品种,均相距甚远,直接利用现有高RS水稻资源的可能性很小,农民种植这些特色资源兴趣也不大,上述原因导致目前高RS水稻产品供应严重匮乏。因此,尽快培育出RS含量高且产量性状优质的高产水稻材料,将是满足功能水稻食品需求的重要手段之一(苏宁,万向元,翟虎渠,,2007,40(3):433-439)。近几年来,国内外水稻育种者尝试通过化学诱变和辐射诱变等方法,创制富含RS的突变体,但目前并没有报道出生产上可用的材料(郭书巧,唐海娟,,29(2):1-5:-,2004(22):365-370),并对RS相关的分子标记进行了初步研究,看出了抗性淀粉与直链淀粉的相关性(牟方贵,闻宗武,冉瑞林,滕建勋,陈永波,杨朝柱,李明辉,吴殿星,水稻抗性淀粉相关SSR标记的初步研究,分子植物育种,2008,6(3):432—438);美国路易斯安那州南部研究中心也发明了一种以大米为基质的RS产品(DarbaniB,EimanifarA,-,2007(2):83-90),但转基因产品目前还存在基因安全性的公众认知度不高以及基因飘逸等潜在的问题,应用起来还有相当距离。因此,常规育种将是当前高RS水稻种质培育的安全和可行的方法之一。通过杂交育种,可将高RS材料与优质高产的水稻材料聚合是水稻优良性状聚合的一种重要方法。研究表明高RS材料多为籼稻(王艳平,李华勇,方先文,林静,不同来源水稻种质的直链淀粉含量多样性分析,金陵科技学院学报,2010,26(3):39-42),而优良食味品质的水稻多是来源于日本的粳稻,比如江苏最好吃的大米粳稻南粳46(严凤根,丁瑞芬,“南粳46”,2011(3):36-37,39),因此,对于聚合高RS和优质高产育种目标,水稻育种工作者将面临地理远源和籼粳杂交常遭遇的育性较低以及白化苗等世界性难题的困饶(KumariM,ClarkeHJjSmallI,:amajorbottleneckinwidehybridization,,2009,28:393-409),培育的难度非常大。特别是RS含量的筛选需要对精米进行加热熟化等破坏性处理才能进行,这种破坏种子育性的鉴定方法,是在Fl代筛选出高RS的水稻材料,无法继续选育,而导致常规选育工作中断;而只能通过常规杂交高世代的分离群体以及回交育种方式选育,不仅大大地增加筛选的水稻材料的工作量,而且又大大增加了RS含量测定的筛选成本,而经过F2代,群体性状严重分离,要想获得稳定的RS水稻种质,必须再经过多次回交等育种方法稳定,这个过程通常需要8-10年,可见,只通过常规杂交育种方法培育高RS功能材料也有很大的局限,尤其是短期要获得稳定、高产和高RS等聚合这3个优良性状的水稻材料,几乎是不可能实现的育种目标。水稻花药培养技术是快速获得稳定远缘杂交Fl代的方法,它可以打破物种的界限进行基因转移,增加遗传多样性。利用花药组织培养具有缩短育种年限优势,同时还可以快速获得符合育种目标的植株,提高育种效率。现阶段,水稻花药组织培养技术还是利用不同品种对外源激素的敏感性的不同而研制出一一对应的花药愈伤组织诱导的独特培养基配方,同时不同基因型材料的花药组织培养力差异巨大,愈伤组织的诱导率及分化率还普遍较低,特别是籼粳杂交子一代的花药培育的再生植株中白化苗的比例也非常高(KumariM,ClarkeHJ,SmallI,:amajorbottleneckinwidehybridization,,2009,28:393-409),%(郭书巧,唐海娟,,29(2):1-5)。水稻花药培养作为常规技术,高效应用到大规模水稻改良还需要技术的优化和提高,目前应用到高RS水稻资源的培育并未见报道发明内容本发明的目的在于:针对了目前的高RS亲本多为农家种,且是产量低且口感差的籼稻,而口感好的优质高产水稻多为粳稻。鉴于培育优质高产的高RS的水稻材料,将涉及地理远缘、籼粳杂交以及后代分离群体大等问题,而且籼粳杂交子一代水稻花药再生技术仍对基因型的高度依赖(包括因花药愈伤组织诱导率较低,分化率低以及白化苗较高等问题),均对现有高RS水稻材料的改良不相适应。本发明通过高RS亲本材料与优质高产亲本材料的选择,并对其籼粳稻子一代花药培养技术的优化,尤其是通过激素和理化因子的调优等,在2年内提供一种适合籼粳杂交和花药培养相结合的培育高RS高产新品种的水稻育种方法。本发明的目的是这样实现的:一种具有高抗性淀粉低直链淀粉的水稻种质的培育方法,其特征在于:a)以至少含有8%的RS的水稻材料为母本,与以直链淀粉含量不超过15%且单株产量不低于40g/株的,符合国标二级优质稻谷标准的水稻材料为父本进行杂交,获得Fl杂种;b)将Fl杂种的单核靠边期花穗,-1厘米的花穗,经75%乙醇消毒后,装入塑料袋内,并经2-5天4°C低温预处理后,花药接种在愈伤组织诱导培养基上进行全暗培养,温度为26±1°C,培养约14-21d后,获得愈伤组织;c)将花药诱导出愈伤组织通过继代培养基培养后,再通过分化培养基分化为植株,或直接将花药诱导出的愈伤组织通过分化培养基分化为植株,得到稳定的花培株系;d)花培株系的绿芽长出3叶后,转接入幼苗壮根培养基中生长15d后,获得根系发达的茁壮试管苗;e)试管苗经7d温室练苗,移栽至简易大棚后,生长健壮的小苗15d左右长出新的分蘖,用秋水仙素在茎节切口涂抹,进行加倍处理,然后移至大田发育成熟,收获二倍体植株结出饱满的种子;f)将收获的种子在田间种植,到收获期,进行产量性状的考察,并对获得水稻株系的精米进行RS和直链淀粉含量的测定,筛选单株产量不低于40g/株,同时精米中RS大于5%、%的稳定水稻株系,作为高RS的水稻种质;所述的愈伤组织诱导培养基为:以N6大量元素、微量元素、有机成分和铁盐为基本组分,附加2,4-二***苯氧乙酸1-+-++脱落酸2mg/L+脯氨酸100mg/L+水解酪蛋白300mg/L+白砂糖60g/L+琼脂条8g/L;所述的继代培养基培养为以M8大量元素、微量元素、有机成分和铁盐为基本组分,白砂糖浓度为50g/L,琼脂条8g/L,-1mg/L2,4-二***苯氧乙酸,2-,2mg/L脱落酸;所述的分化培养基为以MS大量元素、微量元素、有机成分和铁盐为基本组分,白砂糖浓度为30g/L,琼脂条8g/L,-,4-二***苯氧乙酸,2-,2_3mg/L脱落酸;所述的幼苗壮根培养基为以MS大量元素、微量元素、有机成分和铁盐为基本组分,白砂糖浓度为30g/L,琼脂条8g/L;。本发明中,所述的至少含有8%的RS的水稻材料是指:扎西玛,或白银单,或花绿丰;所述的直链淀粉含量不超过15%且单株产量不低于40g/株的,符合国标二级优质稻谷标准的水稻材料是指:南粳46,或武育粳3号,或Koshihikar。本发明中,所述的将花药诱导出愈伤组织通过继代培养基培养后再通过分化培养基分化为植株是指:-1Cm、浅黄色、干燥以及颗粒状愈伤组织,在50ml的三角瓶中接入10个愈伤组织块,转入继代培养基,在20001ux的光强下,14hLight/D下培养,14-21d后,再选取培养后的浅黄色、干燥且颗粒状的愈伤组织,转入分化培养基培养,21-30d后,开始分化,长出绿芽;所述的直接将花药诱导出的愈伤组织通过分化培养基分化为植株,得到稳定的花培株系是指:-1cm、浅黄色、干燥以及颗粒状愈伤组织,在50ml的三角瓶中接入10个愈伤组织块,接入分化培养基培养,21-30d后,开始分化,长出绿芽。本发明的优点在于:克服了聚合多个基因可能带来的费用和沉默的不足,结合常规杂交,生理鉴定和花药培养的特点,形成了一种快速有效的植物育种方法。以水稻为例,随着人民生活水平的提高,培育高产优质的功能食品成为未来研究的重要方向,但是特殊的功能食品都是与独特代谢机制有关,是遗传和环境共同作用的结果,即使通过基因工程的现代生物技术也难以改良,而且还存在公众对转基因产品的认知程度,离推广应用还有相当的距离。本方法通过单个功能特征高RS含量与优质高产特征建立的对应关系,将2个材料进行简单的聚合,克服了多基因导入可能带来的沉默,常规单一杂交育种方法的长周期以及植物生态环境差异造成生理性状的不稳定等难题,通过高RS材料与优质高产水稻材料的杂交,通过花药培养,优化花药愈伤组织诱导和分化等培养基配方,快速稳定的获得高RS的水稻种质。本发明不仅花费低,又便于育种者实施,尤其是花药培养方法的优化,在本发明使用的培养基配方范围内,%出愈率以及不低于40%分化率,%以上,且整个培育周期只有2年,尤其对地理远源和籼粳杂交水稻Fl代材料在花药培养中常遭遇的白化苗高的问题,也有很好的效果。通过本发明可以在2年内获得RS含量不低于5%,直链淀粉不高于15%,且单株产量不低于40g/株的水稻种质,可见,本发明的方法提高了籼粳杂交水稻花药组织培养愈伤诱导率和再生率,开拓了RS功能产品的培育方法,拓宽了通过生物技术改良栽培水稻基因型的范围,并将可能配组或育成新的聚合多个优良性状的优质水稻功能品种,从而提高了水稻生物技术育种效率。图1是不同基本培养基对杂交水稻Fl花药愈伤组织诱导率的影响。图2是不同蔗糖浓度对供试水稻花药愈伤组织出愈率的影响。图3是不同4°C低温预处理时间对供试水稻花药愈伤诱导率的影响。图4是不同低温处理条件下不同激素配比对水稻花药出愈率的影响。图5是籼粳杂交Fl水稻花药通过组织培养的再生体系。图6展示了对籼粳杂交Fl进行花药培养的再生体系,其中:a)花药培养在诱导培养基山)花药培养在培养基上约21d诱导形成愈伤组织;c)愈伤组织在继代培养;d)愈伤组织培养在再生培养基上约14-21d出现绿点;e)再生培养基上绿点形成绿芽;f)再生植株。具体实施方式实施例1扎西玛/南粳46的Fl的获得2011年5月在南京用扎西玛为母本,以南粳46为父本,获得500粒杂种Fl种子,其中扎西玛是云南的地方品种,测定其大米的PS含量为8%,是高RS特色种质资源;南粳46是江苏省农科院粮作所以优质高产粳稻