黑曲霉产植酸酶条件.docx

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其导人大肠杆菌BL21(DE3)中,建立工程菌株BL21-PET21a(+)-phyA。结果植酸酶基因在工程菌株中获取了高效表达,表达量达到菌体蛋白的30%,而且复性蛋白质拥有较好的热牢固性;经过75—95℃,30min的热办理后,依旧保持了生物活性,同时有明显的热激活现象,热激活后最高生物活性达到5000U/mg。Garrett等[22]从植酸酶appA的19个氨基酸残基中32个可能与耐热有关的密码子中优选耐热突变体。获取了在62℃下1h有完好酶活,而在85℃下10min仍有27%的活性的耐热菌株,而且在胃中的牢固性也提高倍。植酸酶的晶体构造分析经过测定的植酸酶的晶体构造,能够进一步认识植酸酶构造与功能之间的关系。近来的研究同样是在重点分析耐热植酸酶的特点和植酸酶在不同样pH值下的构相变化。Xiang等[23]测定了根源于的耐热植酸酶晶体构造,发现该酶Glu35-Ser42中由更多酸性氨基酸而产生的氢键以及Gly163-Arg168和Arg248-Ser254的环状构造中由精氨酸形成的盐键使酶更牢固;其C端螺旋帽构造能使其在高温作用后重折叠成活性形式;其活性中心的His59的磷酸化也促进了其牢固。Liu等[24],确定His59在不同样pH条件下的质子化的不同样对酶活的关键性影响;从与植酸酶的比较发现植酸酶催化位点的口袋更小,以及催化位点右下方的正电荷分别有利于其催化的专一性优选文档优选文档14优选文档和活性。植酸酶的转基因研究转基因微生物现在植酸酶生产都采用微生物发酵的方法,而选择好的生产菌株无疑是重点。研究表示,以真菌作为生产菌株在产量,热牢固性,抗蛋白酶降解等方面都明显优于细菌。这可能与真核表达系统中的糖基化有关。(1)转基因细菌在原核表达中多是源于细菌的植酸酶基因,最多的是appA。Dharmsthiti等[25]将appA基因克隆到pBBRT质粒中,并转入Pseudomonasputida表达。获取最适条件在55℃,,但对胰蛋白酶敏感,不适合饲养。Gerlach等[26]在appA基因前加上了一双精氨酸信号肽,使其能在Bacillussubtilis中胞外分泌表达。这使生产后加工过程获取必然程度的简化。(2)转基因真菌真核微生物表达系统的植酸酶根源较为多样。由不同样的表达系统获取的植酸酶,其性质也有不同样,而在同一种菌株中优选文档优选文档15优选文档也会因翻译后修饰不同样而有所差别。Lee等[27]将中的appA2优选文档优选文档16优选文档分别在haromycescerevisiae(pYES2),haromyces优选文档优选文档16优选文档pombe(pDS472a),和Pichiapastoris(pPICZalphaA)(pGAPZalphaA)中组成性表达。四种都获取了表观分子质量在ku的胞外活性的appA2。在引诱型Pichia系统中获取的植酸酶产量最高,,但其有较高的耐热性。优选文档优选文档16优选文档