下载此文档

一种小鼠卵巢组织液的提取方法及其应用的制作方法.docx


文档分类:论文 | 页数:约9页 举报非法文档有奖
1/9
下载提示
  • 1.该资料是网友上传的,本站提供全文预览,预览什么样,下载就什么样。
  • 2.下载该文档所得收入归上传者、原创者。
  • 3.下载的文档,不会出现我们的网址水印。
1/9 下载此文档
文档列表 文档介绍
该【一种小鼠卵巢组织液的提取方法及其应用的制作方法 】是由【开心果】上传分享,文档一共【9】页,该文档可以免费在线阅读,需要了解更多关于【一种小鼠卵巢组织液的提取方法及其应用的制作方法 】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种小鼠卵巢组织液的提取方法及其应用的制作方法专利名称:一种小鼠卵巢组织液的提取方法及其应用的制作方法技术领域:本发明涉及小鼠卵母细胞的体外培养,特别涉及一种小鼠卵巢组织液的提取方法及其应用。背景技术:在生命科学研究蓬勃发展的今天,实验动物在科学研究中的作用日益突出。小鼠是应用最为广泛的实验动物之一,C57BL/6J品系小鼠作为一种近交小鼠,因其遗传背景稳定,成为生殖生物学、肿瘤学、生理学、免疫学和遗传学研究中常用的品系,大多数转基因小鼠均以C57BL/6J小鼠为遗传背景制作出来。如何对这些基因工程小鼠进行科学保种,建立一套有效的小鼠种质资源保存方案显得尤为重要。目前,体外受精技术和胚胎冷冻技术相结合,已经成熟地应用于了小鼠资源保存工作中,而小鼠卵母细胞体外成熟属于体外胚胎生产的基础环节之一,不仅可以辅助完成小鼠保种工作,而且在研究不孕症治疗模型方面也有着广阔的应用前景,同时它还可以对突发情况死亡的小鼠进行再生。因此,研究小鼠卵母细胞体外成熟具有重要的实际意义。但小鼠卵母细胞体外成熟是一个复杂的过程。目前的研究报道中,虽然大多数小鼠卵母体外成熟后能进行体外受精并能获得胚胎,但是体外受精后的卵裂率低,%,胚胎的质量较低,胚胎的继续发育能力差,长期以来人们更多注重直接采取小鼠体内成熟卵子或胚胎进行相关实验;通过体外成熟,结合体外受精和胚胎移植得到试管小鼠并未受到足够的重视。随着转基因小鼠的生产与繁育保种的需求不断增加,小鼠卵母细胞体外成熟、体外受精技术研究显得愈益迫切,具有广阔的应用前景。因此,本发明以C57BL/6J小鼠为研究对象,任务是建立较完善的小鼠卵母细胞体外成熟体系、提高体外成熟卵子的卵裂率、提高体外胚胎的发育能力、并通过胚胎移植获得试管小鼠。最终为重要优良小鼠品系的辅助保种,重要遗传工程小鼠品系的扩群和保种,自然生育困难的小鼠品系的扩群和保种,和濒危和突发情况死亡小鼠的再生,提供技术支持,为其它物种的资源保存和繁育提供技术参考。发明内容为了克服体外成熟卵子受精率低,受精后胚胎发育能力差的问题,本发明提供一种小鼠卵巢组织液的提取方法及其应用。为了解决上述技术问题,本发明采用如下方案—种小鼠卵巢组织液的提取方法,将小鼠的卵巢置于基础培养液中轻轻捣碎并离心,使卵巢组织液溶于所述基础培养液中形成预培养液。所述基础培养液为M16溶液。一种小鼠卵母细胞体外成熟的培养方法,包括将小鼠的未成熟卵母细胞移入成熟培养液中进行体外培养,其特征在于,将根据权利要求1或2所述的小鼠卵巢组织液的提取方法得到的所述预培养液添加到卵母细胞基础培养液中形成所述成熟培养液。所述卵母细胞基础培养液为M16溶液。所述预培养液中的每400μLΜ16溶液中含有20枚卵巢捣碎提取的卵巢组织液。所述成熟培养液中含有胎牛血清。所述成熟培养液中的Μ16溶液、胎牛血清和预培养液的体积比为811。所述成熟培养液在进行体外培养之前需要在37°C,湿度100^,5%CO2培养箱中进行平衡。每滴所述平衡过的成熟培养液中培养2050枚所述未成熟卵母细胞。所述体外培养的培养条件为37°C,湿度100^,5%C02。一种胚胎移植获得试管小鼠的方法,包括将成熟卵母细胞进行体外受精和胚胎移植,其特征在于,根据权利要求3所述的小鼠卵母细胞体外成熟的培养方法获得所述成熟卵母细胞。所述体外受精包括制作精子获能皿和体外受精皿。通过本发明所提供的卵巢组织液在小鼠卵母细胞体外成熟中的应用,有效提高了体外成熟卵子受精后的卵裂率,使其与体内成熟卵子的卵裂率无显著差异,最终通过胚胎移植还获得了试管小鼠。图1是显微镜下分离到的未成熟卵母细胞,周围有卵丘细胞包裹(X200);图2是未成熟卵母细胞经过本发明的培养液培养成熟后的显微形态,周围卵丘细胞扩散开来(X200);图3是成熟后进行体外受精所得到的2-细胞胚胎(X200);图4是胚胎移植后所得到的子代,出生当天;图5是子代出生后第9天(黑色)及其代孕母鼠(白色);图6是子代出生后健康成长到第60天。具体实施方式以下详述本发明的具体实施例。本发明的具体实施例中所涉及的实验动物SPF级C57BL/6J小鼠,雌性,4周龄;C57BL/6J小鼠,雄性,10周龄以上,均由中科院上海实验动物中心提供,许可证号为沪SCXK(沪)2007-0005。按SPF级标准分群饲养,自由采食、饮水。本发明的具体实施例中所涉及的主要仪器设备与器械CO2培养箱(Hera,cell,Kandro);实体显微镜(Nikon,SMZ645);倒置显微镜(Leica,521665);冷冻离心机(印pendorf5415R);移液枪(Gilson);手术器械;ing)。本发明的具体实施例中所涉及的主要试剂M16培养液(Sigma公司,M7^2);本领域技术人员公知的HTF溶液和KSOM培养液。实施例11、激素配制及贮存孕马血清(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)用灭菌生理盐水配制成浓度为50IU/mL的溶液,_20°C保存备用。2、预培养液的制备小鼠卵巢体积小,成年小鼠的卵巢直径约34mm,组织液含量更是少,要提取纯卵巢组织液可行性差且耗费颇大,本发明采用以基础培养液为溶剂,将卵巢置于基础培养液中进行捣碎并离心,使卵巢组织液溶于基础培养液中,这种提取方法步骤简单、操作方便。具体方法是用本实验室超数排卵用于保种的4周龄雌性小鼠,腹腔注射PMSGIOIU/只,4后再腹腔注射hCGlOIU/只,15h左右后分离小鼠卵巢,在经预平衡过的M16溶液中洗23遍,,按每管中20枚卵巢和400μL的Μ16溶液分装,用自制的尖头玻璃棒在离心管内,轻轻将卵巢组织捣碎,3000r/min离心5min,取上清再5000r/min离心5min,,封口胶封口,_20°C保存备用。3、成熟培养液的配制本发明采用的基础培养液是通过试验研究筛选出来的M16溶液,而在培养液中添加胎牛血清(FBQ已经是相关研究中常用的方法。本发明中,在进行体外成熟的前晚,按M16FBSmOTF为811的比例配制,混均后作成100μL微滴于;35_培养皿中,每皿4个微滴,覆盖石蜡油,于37°C,湿度100%,5%CO2培养箱中隔夜平衡,备用。4、雌鼠的激素处理与卵母细胞分离培养PMSG处理腹腔注射PMSG溶液,IOIU/只,48h后用于实验。小鼠的处死及其卵母细胞的分离培养颈椎脱臼处死小鼠,干净分离出卵巢,在M16培养液中清洗23遍,然后用显微镊在实体显微镜下反复轻轻夹镊卵巢,使未成熟卵母细胞从卵巢上卵泡内游离出来,用移卵针选择卵丘卵母细胞复合体(plexes,C0C)(如图1),移入平衡过的成熟培养液M16中清洗23次,再放到35mm培养皿中的成熟培养液中培养,每滴中培养2050枚未成熟卵母细胞。然后将培养皿放在37°C,湿度100%,5%CO2的培养箱中培养。5、精子获能皿与受精皿的准备体外受精前一晚,准备精子获能皿和体外受精皿。获能皿的制作方法是用HTF作200μ1微滴于35mm培养皿中,每皿2个微滴,覆盖石蜡油;体外受精皿的方法是用HTF作160μ1和100μ1各两个微滴于35mm培养皿中,呈十字轴对称排列,覆盖石蜡油;做好的获能皿、体外受精皿和2支HTF溶液都于37°C、湿度100^^5%CO2培养箱中平衡过液,备用。6、卵母细胞的准备未成熟的COC培养1后,将卵丘细胞扩散了的COC判定为成熟(如图2所示),将选取的COC转入平衡过的HTF中洗涤23次,再分别转入平衡过的受精皿中的大滴中,每滴约2050个卵子,等待受精。7、体外受精采集新鲜精子放入获能皿里微滴获能,每只小鼠的精子用1个微滴;获能时间到时,用移液枪吸取ομ1获能好的精液轻轻吹入受精滴中与成熟的卵子共孵育24h后洗胚,统计2-细胞胚胎数量及卵裂率。图3示出了成熟后进行体外受精所得到的2-细胞胚胎(X200)。8、假孕鼠的准备做体外受精的当天,选择成年的阴门红肿的ICR/JCL雌鼠与结扎过的ICR/JCL雄鼠进行11合笼,次日早晨对雌鼠进行阴栓检查,见栓者判定为假孕小鼠,用作胚胎移植的受体。9、%戊巴比妥钠按麻醉剂量表(表1)进行麻醉,小鼠进入麻醉状态后,背部腰侧切开Icm左右切口,然后切开腹肌,打开腹腔后用镊子轻轻引出卵巢及子宫,在卵巢与子宫之间的位置可见到弯曲的输卵管及膨大部,用夹子固定卵巢的脂肪垫,将动物移入体视显微镜下,用显微镊子夹住脂肪垫,找到膨大部,并调整好位置便于操作,用直头维纳斯剪在膨大部靠卵巢端剪一微口。,其特征在于,将小鼠的卵巢置于基础培养液中轻轻捣碎并离心,使卵巢组织液溶于所述基础培养液中形成预培养液。,其特征在于,所述基础培养液为M16溶液。,包括将小鼠的未成熟卵母细胞移入成熟培养液中进行体外培养,其特征在于,将根据权利要求1或2所述的小鼠卵巢组织液的提取方法得到的所述预培养液添加到卵母细胞基础培养液中形成所述成熟培养液。,其特征在于,所述卵母细胞基础培养液为M16溶液。,其特征在于,所述预培养液中的每400μLΜ16溶液中含有20枚卵巢捣碎提取的卵巢组织液。,其特征在于,所述成熟培养液中含有胎牛血清。,其特征在于,所述成熟培养液中的Μ16溶液、胎牛血清和预培养液的体积比为811。,其特征在于,所述成熟培养液在进行体外培养之前需要在37°C,湿度100%,5%CO2培养箱中进行平衡。,其特征在于,每滴所述平衡过的成熟培养液中培养2050枚所述未成熟卵母细胞。,其特征在于,所述体外培养的培养条件为37°C,湿度100%,5%C02。,包括将成熟卵母细胞进行体外受精和胚胎移植,其特征在于,根据权利要求3所述的小鼠卵母细胞体外成熟的培养方法获得所述成熟卵母细胞。,其特征在于,所述体外受精包括制作精子获能皿和体外受精皿。全文摘要本发明提供一种小鼠卵巢组织液的提取方法,将小鼠的卵巢置于基础培养液中捣碎,使卵巢组织液溶于基础培养液中形成预培养液。本发明还提供一种小鼠卵母细胞体外成熟的培养方法,包括将小鼠的未成熟卵母细胞移入成熟培养液中进行体外培养,所述成熟培养液由所述预培养液添加到卵母细胞基础培养液中形成。此外,本发明还提供一种胚胎移植获得试管小鼠的方法,包括将根据上述体外成熟的培养方法培养成熟的卵母细胞进行体外受精和胚胎移植。通过本发明所提供的卵巢组织液在小鼠卵母细胞体外成熟中的应用,有效提高了体外成熟卵子受精后的卵裂率,使其与体内成熟卵子的卵裂率无显著差异,最终通过胚胎移植获得试管小鼠。

一种小鼠卵巢组织液的提取方法及其应用的制作方法 来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.

相关文档 更多>>
非法内容举报中心
文档信息
  • 页数9
  • 收藏数0 收藏
  • 顶次数0
  • 上传人开心果
  • 文件大小20 KB
  • 时间2024-04-17