一种含有更多丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶gpx1突变体及其制备方法.docx

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(GSH)亲和层析纯化GPXl突变体蛋白,透析冻干后即得GPXl突变体蛋白纯品。用变性聚丙烯酰***凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Westernblot)鉴定目标蛋白。[0024]该方法通过低温下诱导营养缺陷型原核表达系统在GPXl突变体的底物结合部位引入了催化基团,因而产生高活力的GPXl突变体。[0025]所述的用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPXl突变体蛋白,,50mmol/LTris-Cl平衡并洗脱杂蛋白,用含lOmmol/LGSH的缓冲液洗脱目的蛋白。[0026]所述的将液体低温离心,可以在4°C,8000_12000g离心15_30min。[0027]本发明的第二种方法是先扩增GPXl基因,然后以其为模板,用基因突变法获得能表达本发明所述的GPXl突变体蛋白的基因,并在保证其氨基酸序列不变的前提下突变掉基因中的ACA序列,获得不含ACA的GPXl突变体基因,再用单一蛋白生产系统和营养缺陷型原核表达系统联合制备GPXl突变体蛋白。[0028]1)、表达载体的构建:[0029]根据基因文库中公开的GPXl的基因序列(参见NCBI,)设计引物,扩增其编码基因,在设计引物时,确保基因的5'端含有起始密码子(ATG),3'端含有终止密码子,且两端都含有特定的酶切位点,确保第2和202位Cys的密码子替换成Ser的密码子,其它氨基酸序列不变;用相同的限制性核酸内切酶切割载体和靶基因后,再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPXl基因组装到分泌型原核表达载体上(如pCold系列等);在保持其它氨基酸序列不变的前提下,根据GPXl中要突变为半胱氨酸的49位硒代半胱氨酸和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物,以突变氨基酸的密码子为中心,引物长