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一株粘液真杆菌及其应用的制作方法.docx


文档分类:医学/心理学 | 页数:约16页 举报非法文档有奖
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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一株粘液真杆菌及其应用的制作方法一株粘液真杆菌及其应用的制作方法本发明公开了一株粘液真杆菌及其应用。本发明所提供的粘液真杆菌具体为粘液真杆菌(Eubacterium?limosum)ZL-II,?;本发明所提供的应用具体为所述粘液真杆菌(Eubacterium?limosum)ZL-II??。本发明所提供的粘液真杆菌(Eubacterium?limosum)ZL-II??,本发明所提供的生产肠二醇的工艺简单、生产成本低、无环境污染,适宜于大规模生产,具有重要的经济效益。【专利说明】一株粘液真杆菌及其应用【技术领域】[0001]本发明涉及一株粘液真杆菌及其应用,特别涉及一株粘液真杆菌及其在生产肠二醇中的应用。【背景技术】[0002]近年来植物雌激素类物质因其广泛的生理、药理学作用已引起广泛关注。肠二醇(enterodiol,END)是国际公认的植物雌激素,具有类雌激素和抗雌激素双向调节作用,以及抑制肿瘤、抗氧化、预防和治疗心血管疾病等多方面药理活性。[0003]肠二醇主要存在于哺乳动物体内,亦被称为哺乳动物木脂素。目前获得肠二醇的主要途径为化学合成方法,但化学合成法成本较高,且污染环境。研究结果表明人体肠道菌群能够转化植物中的多种木脂素类成分而生成为肠二醇,常见的木脂素类成分包括开环异落叶松树脂酹二葡萄糖苷(secoisolariciresinoldiglucoside,SDG)>开环异落叶松树月旨(secoisoIariciresinoI,SECO)>罗汉松月旨酌'(matairesinol,MAT)、落叶松树脂醇(lariciresinol,LCS)>松脂醇(pinoresinol,PRS)>松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinoldiglucoside,PDG)>丁香树月旨酌'(syringaresinol,SYG)>牛蒡苷兀(arctigenin,ATG)>7-羟基罗汉松脂酌O-1iydroxymatariresinol,HYM)>牛蒡子苷(arctiin,ARC)、芝麻脂素(sesamin)。富含此类成分的主要植物资源有亚麻籽(flaxseed)、牛蒡子(ArctiiFructus)、海藻(seaweed)、油菜子(rapeseed)、黑小麦(triticale)、大豆(soybean)、燕麦(oatbran)、玉米糠(cornbran)、麸皮等。[0004]亚麻籽被认为是含有肠二醇前体物质最丰富的植物资源,榨油后的残渣(亚麻籽柏)中SDG的含量可达到12~24mg/g。【发明内容】[0005]本发明的目的是提供一株粘液真杆菌及其应用。[0006]本发明所提供的粘液真杆菌是人体肠道活性菌,自中国人体的肠道内容物中分离得到,具体为粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)ZL-1I,该菌株已于2012年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110:,地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号),。[0007]本发明的另一个目的是提供一种生产肠二醇的菌剂。[0008]本发明所提供的生产肠二醇的菌剂的活性成分为上述粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)ZL-、单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)Strain-(Eggerthellalenta)ZL-。[0009]所述生产肠二醇的菌剂中的三株菌可分别独立包装,使用时混合;也可以混合包装。[0010]上述菌剂在生产肠二醇(END)中的应用也属于本发明的保护范围。[0011]所述应用中,可以下述物质中的至少一种作为底物:开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷、开环异落叶松树脂酚、罗汉松脂酚、落叶松树脂醇、松脂醇、松脂醇二葡萄糖苷、丁香树脂酚、牛蒡苷元、7-羟基罗汉松脂酚、牛蒡子苷、芝麻脂素;亚麻籽、牛蒡子、海藻、油菜子、燕麦麸、黑麦麸、小麦麸、大麦麸和玉米麸。其中前11种物质为11种化学成分,后9种物质来自于9种植物。在实际应用中,根据需要对所述后9种物质进行适当的加工,如研磨粉碎获得粗粉,从而利于反应的进行,使反应更加充分。[0012]在本发明的一个实施例中,所述9种物质经研磨粉碎后获得粗粉粒径为200μm~1000μm。[0013]在所述应用中,具体为以上述三株菌的活性混合菌液进行底物转化反应获得肠二醇。所述活性混合菌液可由所述三株菌的混合菌液进行増菌获得,也可由所述三株菌分别单独増菌后再混合而获得。所述増菌条件为25~40°C厌氧培养10-36小时。[0014]本发明的又一个目的是提供一种活性成分为所述粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)ZL-。[0015]本发明还保护所述粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)ZL-(Eubacteriumlimosum)ZL-***中的应用。[0016]在本发明中,所述粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)***中的应用具体体现在将开环异落叶松树脂酚(SECO)经所述脱***后转化为4,4'-二羟基肠二醇(4,4'-dihydroxyenterodiol,DHEND)。[0017]所述粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)ZL-(Eubacteriumlimosum)ZL-,4'-二羟基肠二醇中的应用也属于本发明的保护范围。[0018]在上述应用中,可以开环异落叶松树脂酚作为底物。[0019]在本发明上述所有的应用中,均采用厌氧培养的方式进行菌液培养,从而转化底物。[0020]所述厌氧培养的温度可为25~40°C。在本发明的实施例中,具体为37°C。[0021]为了使产物如肠二醇的产量达到峰值,通常需要在上述培养条件下培养:1-10天时间。[0022]本发明的还一个目的是提供一种生产肠二醇的方法。[0023]本发明所提供的生产肠二醇的方法具体依次包括如下步骤:[0024](I)将菌体含量均为5~9X107cfu/mL的粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)ZL-、单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)Strain-(Eggerthellalenta)ZL-:1:1的比例混合,得到混合菌液;[0025](2)取步骤(1)中得到的混合菌液,按照体积比1:10的比例接种到厌氧液体培养基中,37°C厌氧培养24h,得到増菌液;[0026](3)将步骤(2)获得的増菌液,按照体积比1:10的比例接种到发酵培养基中,同时向培养体系中加入如下(al)_(a4)中任一底物,37°C厌氧培养3~10天(如8天),从培养液中获得肠二醇:[0027](al)终浓度为2(T40mg/mL(如20mg/mL或40mg/mL)的亚麻籽柏;[0028](a2);[0029](a3)终浓度为30mg/mL的底物A;所述底物A为如下中的至少一种:牛蒡子、海藻、油菜子、燕麦麸、黑麦麸、小麦麸、大麦麸和玉米麸;[0030](a4);所述底物B为如下中的至少一种:开环异落叶松树脂酚、罗汉松脂酚、落叶松树脂醇、松脂醇、松脂醇二葡萄糖苷、丁香树脂酚、牛蒡苷元、7-羟基罗汉松脂酚、牛蒡子苷、芝麻脂素。[0031]在上述方法中,所述厌氧液体培养基由蛋白胨、酵母粉、大豆粉、牛肉粉、葡萄糖、***化钠、可溶性淀粉、半胱氨酸、磷酸二氢钾、***化血红素、:::::::::::1L的比例混合配制而成,±。[0032]所述庖肉培养基由蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、NaH2PO4、葡萄糖、::::::1L的比例混合配制而成,。[0033]当步骤(3)中为(al)所述底物时,步骤(1)中所述发酵培养基具体为无碳源培养基;所述无碳源培养基由NaCl、NH4Cl,::100mL:900mL的比例混合配制而成,;所述PBS由KH2PO4'::1L的比例混合配制而成。当步骤(3)中为(a2)_(a4)所述底物时,步骤(1)中所述发酵培养基具体为庖肉培养基或厌氧液体培养基。[0034]本发明还涉及一种分离纯化发酵液中肠二醇的方法。厌氧培养:TlO天后,离心取上清液,用大孔树脂色谱柱进行分离纯化,采用乙醇-水溶液或甲醇-水进行梯度洗脱,收集含有肠二醇的洗脱液,减压浓缩干燥,得到肠二醇;所述大孔树脂色谱柱具体可为XAD-2大孔树脂或DlOl大孔树脂。[0035]本发明所提供的粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)ZL-。本发明所提供的生产肠二醇的工艺简单、生产成本低、无环境污染,适宜于大规模生产,具有重要的经济效益。[0036]保藏说明[0037]分类命名:粘液真杆菌[0038]拉丁名:(Eubacteriumlimosum)[0039]参椐的生物材料:ZL-1I[0040]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心[0041]保藏机构简称:[0042]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号[0043]保藏日期:2012年11月20日[0044]保藏中心登记入册编号:[0045]分类命名:迟缓埃格特菌[0046]拉丁名:(Eggerthellalenta)[0047]参椐的生物材料:ZL-1II[0048]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心[0049]保藏机构简称:[0050]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号[0051]保藏日期:2012年11月20日[0052]保藏中心登记入册编号:[0053]分类命名:单形拟杆菌[0054]拉丁名:(Bacteroidesuniformis)[0055]参椐的生物材料:Strain-1[0056]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心[0057]保藏机构简称:[0058]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号[0059]保藏日期:2011年5月25日[0060]保藏中心登记入册编号:【专利附图】【附图说明】[0061]图1为ZL-1I菌株的16SrRNA基因序列同源性分析及鉴定结果。其中,StrainZL-1I菌株即表示ZL-1I菌株。[0062]图2为三株菌的不同接种方式转化亚麻籽柏产生肠二醇(END)的结果比较图。其中,“单独接菌”表示三株菌单独増菌24h再混合后接种;“混合接菌”表示三株菌混合后増菌24h再接种。[0063](secoisolariciresinoldiglucoside,SDG)为底物的三株菌随机组合培养48h的HPLC色谱图。其中,StrainI表示单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)Strain-;StrainZL-1I表不粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)ZL-;StrainZL-1II表不迟缓埃格特菌(Eggerthellalenta)ZL-。[0064]图4为三株菌在开环异落叶松树脂酹二葡萄糖苷(secoisolariciresinoldiglucoside,SDG)转化产生不同产物(SEC0,DHEND,END)过程中的作用。其中,StrainI表示单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)Strain-;StrainZL-1I表不粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)ZL-;StrainZL-1II表不迟缓埃格特菌(Eggerthellalenta)ZL-。【具体实施方式】[0065]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。[0066]下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。[0067]下述实施例中所涉及的培养基如下:[0068]厌氧液体培养基(购自北京陆桥技术有限责任公司,产品目录号CM1513)。成分(g/L):;;;;;***;;;;***;,±。[0069]庖肉培养基:称取32g庖肉培养基基础(购自北京陆桥技术有限责任公司,产品目录号CM605),摇匀,加石蜡油覆盖,121°C高压灭菌20min待用。所制得的庖肉培养基(IL)中含有如下组分:蛋白胨(),牛肉粉(),酵母粉(),NaH2PO4(),葡萄糖(),可溶性淀粉(),。[0070]无碳源培养基=NaCl(),NH4Cl(LOg),PBS(IOOmL),去离子水900(mL),pH

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