高通量单核苷酸多态性检测方法.docx

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4min;然后95°C变性lmin,70°C退火2min30s,72°C延伸30s,共35个循环;最后,72°C再延伸lOmin。向30μL的PCR产物体系中加入2U的碱性磷酸酶以及6UExoI酶后,37°C反应60min,然后95°C5min将酶灭活,处理好的PCR产物留着下一步待用。(d)30yL反应体系包括Iinker-PCR全基因组扩增产物15μL,3yL的IOXThermoSequenase的反应缓冲液,(10μmol/L),0·6μLTAMRA-ddGTP(10μmol/L),(10ymol/L)混合液,3UThermoSequenaseDNA聚合酶(5U/yL),44°C延伸7min。(e)延伸反应后的磁性颗粒微阵列经2XSSC-%SDS(质量体积比)、-%SDS(质量体积比)和3XSSC各缓缓地振荡和清洗各两次,每次3min。将表面杂交上荧光探针的磁性纳米颗粒点阵列通过100°c热台快速烤干后,取下载玻片另一面的磁体,以备扫描。通过生物芯片扫描仪,对样品的分型结果进行分析。上述处理后的玻片经4100A扫描微阵列分析系统(Axon,USA)扫描以获得样品分型图像。实施例2本发明涉及一种高通量单核苷酸多态性检测方法,实施方案具体如下(a)无荧光背景的磁性颗粒的制备采用了Lin等[JournalofSolidStateChemistry,2001,159:26_31]方法制备了一种金磁颗粒,有效消除磁性颗粒的荧光曲旦冃足°(b)选取多个SNP位点,根据SNP位点的序列设计延伸引物。延伸引物的设计原则为各个位点的延伸引物具有相似的Tm值,其5’端经过巯基修饰,3’端最后一个碱基与待测位点互补。(c)将5’端经过修饰的单碱基延伸引物应用Au-S键共价结合固定在功能化的磁性颗粒表面,制备磁珠引物。(d)磁珠颗粒阵列制备示意图附图1所示,包括载玻片、永磁体、聚二***硅氧烷(PDMS)杂交反应池(制备方法参见Pantojaetal,BiosensorsandBioelectronics,2004,20(3):509-517)、磁性颗粒引物、杂交池盖片五部分组成。其中用磁铁粘附在玻片点样区的背面,磁性颗粒点样在杂交反应池中,当需要检测多种不同位点时,需制备四个相同