高效双启动子PLEGFP-N1-spMyoD1绿色荧光逆转录病毒载体构建及使用方法.docx

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/A克隆到pMD18_T载体中,双酶切后将融合基因亚克隆入以真核表达绿色荧光蛋白为标记的逆转录病毒PLEGFP-N1载体,构建PLEGFP-Nl-spMyoDl双启动子高效表达载体,经限制性内切酶鉴定并测序。用脂质体法转染293T细胞系包装、扩增,对病毒滴度和感染效率进行监测。本发明的具体技术方案是1引物设计根据GenBank中已发表的猪MyoDl基因mRNA序列(),,,预期扩增长度为960bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物Pl:5'-GCTC-3‘;下游引物P2:5'-TGGTAGATAGG-3';2PCR扩增的反应条件用引物Pl和P2从RT-PCR产物cDNA扩增长度为960bp(lbp960bp)的编码区序列。反应程序95°C预变性5min,进入循环95°C变性30s,58°C退火40s,72°C延伸2min,循环总数:30circles;最后延伸72°C4min。3骨骼肌组织特异性高效表达启动子(SP)的合成参考GenBank中已发表的老鼠染色体1和2基因组的部分5、侧翼调控区的保守序列(,NW_001030694,NW_001030671)和鸡骨骼肌组织α-actin基因的顺式作用调控与转录控制区核心序列(),优化并合成了骨骼肌组织特异性高效表达启动子(SP)序列,启动子SP序列见附件2。在其;T末端人工接一长为24bp的寡聚核苷酸接头。接头序列5'-TCGACGACAGCGGTGGCGAG-3‘。4SP与pMyoDl融合基因的重叠PCR扩增根据已合成的带接头的SP启动子序列和扩增到的pMyoDl基因cDNA序列,,预期扩增长度为1240bp。在NCBIGENEBANK中找到基因序列后,看选择的酶切位点,在所要进行PCR的基因序列中是否存在;用Primerprimer5把序列反向互补;,上下游引物全长输入;上游引物位点的确定为5’端模板第一个碱基前面的所有碱基(包括酶切位点+保护碱基)的负数值+1下游引物位点的确定为下游引物-酶切位点-保护性碱基=A,序列全长-A+1=下游引物位点。引物设计时候要考虑到序列的起始碱基和末尾碱基中是否包含起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA),如果有,要考虑是否需要删除或者保留。引物长度的选择要考虑到CG比例,酶切位点的选择要兼顾廉价,常用,而且要兼顾其加入后引物的GC比例