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马立克氏病病毒和j亚群禽白血病病毒快速联检试纸条的制作方法.docx


文档分类:医学/心理学 | 页数:约23页 举报非法文档有奖
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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。马立克氏病病毒和j亚群禽白血病病毒快速联检试纸条的制作方法专利名称:马立克氏病病毒和j亚群禽白血病病毒快速联检试纸条的制作方法技术领域:本发明涉及一种检测马立克氏病和J亚群禽白血病的器具,特别是涉及一种一步法快速检测马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒的联检胶体金试纸条。背景技术:马立克氏病(Marek,sdisease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek,sdiseasevirus,MDV)引起的一种禽类高度接触性、传染性、淋巴组织增生性肿瘤病,主要危害鸡,鹌鹑、山鸡也有发病。该病可引起内脏器官、肌肉和外周神经的淋巴细胞瘤的神经肿大。临床上MD发病鸡群表现为生长不均匀、极度消瘦、死亡等症状,最常见的病变是神经损害和多种实质脏器的淋巴肿瘤,以肝脏、脾脏肿瘤最为多见,因神经损害导致的不对称性进行性麻痹,最终可引起单个或多个肢体的完全性麻痹。MDV属于疱疹病毒科,有三种不同血清型,不同血清型毒株既含有共同抗原,也含有特异性抗原。I型MDV感染能引起肿瘤,II型和III型MDV毒株无致病性,可用于疫苗株。禽白血病(AvianLeukosis,AL)是由反转录病毒科甲型反转录病毒属禽反转录病毒(AvianLeukosiSvirus,ALV)引起的以禽类造血组织中某些细胞成分增生为主的各种可传染的肿瘤疾病,其中以禽淋巴细胞性白血病和***的髓细胞性白血病常见。ALV根据囊膜糖蛋白的抗原决定簇分为A、B、C、D、E和J等不同亚群。J亚群禽白血病病毒(ALV-J)主要引起鸡的骨髓细胞瘤或骨髓白血病和多种细胞类型的恶性肿瘤,是一种新的禽白血病病毒亚群,它可通过垂直和水平传播在鸡群中广泛散播,主要引起***的髓细胞瘤。ALV-J属于外源性白血病病毒,是引起禽免疫抑制性和肿瘤性疾病最重要的病毒之一。(该段有删节)MDV和ALV-J作为能诱发禽类免疫抑制病和肿瘤病最重要的两种病毒,这两种病毒可单独感染,也可共感染。研究发现MDV和ALV-J可同时感染同一鸡群、同一只鸡,甚至同一细胞,并且病毒发生了重组,这种重组病毒的生物学特性已发生改变,这种嵌合分子是在鸡体内发生的。由于MDV能增强ALV诱导的淋巴细胞瘤,所以混合感染使肿瘤发生率明显提高,使当前家禽肿瘤性疾病变得越发复杂。MDV和ALV-J共感染的现象在我国鸡群已普遍发生,表现出发病急、肿瘤明显、死淘率高、宿主范围扩大等特点。由于临床症状和剖检病变非常相似,增加了这两种病毒性肿瘤病的临床诊断尤其是鉴别诊断的难度,一些传统的诊断方法很难将其准确、快速地区分开来,给兽医临床诊断及防制工作带来困难。目前,临床上最常用的鉴别诊断方法是病毒分离培养、血清学检测、分子生物学方法等。病毒分离鉴定不但对临床诊断很有价值,对流行病学及病原学研究亦至关重要,但该方法检测周期长,约需I2个月,同时细胞培养的操作要求高,局限性较大。血清学方法如酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光法(IFA)和免疫组织化学法(SP)等主要用于检测羽毛囊上皮、溶细胞感染的淋巴细胞组织及发病鸡的多种器官组织样品等。此类方法检测成本相对较高,并且试验操作较复杂,一般养殖场工作人员很难掌握。分子生物学方法如PCR、RT-PCR和荧光定量PCR等技术主要是用于病毒核酸的检测,这些技术虽然能比较准确的鉴别诊断MDV和ALV-J,但操作复杂,需要特定的试剂及昂贵的仪器设备,操作要求高,难以适合生产一线或疫病现场快速鉴别诊断的需要,并且由于ALV-J抗原的变异,普通的PCR检测,特别是那些基于env基因序列的分子生物学方法需定期修正特异性引物,以确保能检测到新的突变毒株。因此,急需研究一种快速鉴别检测MDV和ALV-J的新技术,这对于MD和AL的有效防控具有重要的现实意义。发明内容本发明要解决的技术问题是:提供一种简便、准确、结果直观、肉眼可判的一步法快速检测马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒的试纸条,该试纸条特异性强、灵敏度高、操作简便、检测快速、成本低廉,并且可以同时检测这两种病毒。为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:一种一步法快速检测马立克氏病病毒MDV和J亚群禽白血病病毒ALV-J的试纸条,包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层,所述吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成,所述纤维素膜层上标记有抗羊IgG或抗小鼠IgG的对照印迹,以及分别含有MDV抗体和ALV-J抗体的检测印迹,所述MDV抗体和ALV-J抗体分别为抗MDV和抗ALV-J的单克隆抗体或多克隆抗体;所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗MDV和抗ALV-J的多克隆抗体或单克隆抗体。所述纤维素膜层由***纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜或聚偏二***乙烯膜制成;所述样品吸附纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。所述支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成;所述吸水层用吸水纸制成;所述金标抗体纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。在所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水层上敷设有保护膜,,检测印迹与对照印迹的排列组合为“III”、“///”、“+++”、“丁丁丁”、“|_p’中的一种。所述胶体金标记的抗MDV和抗ALV-J的单克隆抗体是通过以下方法制备的:将筛选获得的抗MDV和抗ALV-J的单克隆细胞株分别进行扩大培养,用PBS洗涤2遍后1000r/min离心10min,收集细胞,以每只IXIO62XIO6个细胞的量分别对经产母鼠进行腹腔注射,1020d后采集小鼠腹水,4000r/min离心10min后取上清,分别获得抗MDV和抗ALV-J的单克隆抗体腹水;用柠檬酸钠还原法制备金溶胶:%%(wt)***%(wt)柠檬酸三钠溶液,反应后获得直径为1520nm的胶体金溶胶;.5,以1:10001:1300的印迹比将所述抗MDV的单克隆抗体腹水或抗ALV-J的单克隆抗体腹水分别加入胶体金溶胶中,印迹10min后,加20%(wt)的PEG-10000至PEG-%(wt),4°C下、15003000r/min离心20min,除去未结合的胶体金颗粒,在4°C、15000r/min条件下离心Ih,弃上清液,获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物;然后用丙烯葡聚糖S-400柱层析,分别分离纯化金标蛋白,得到胶体金印迹的抗MDV单抗和抗ALV-J单抗。所述抗MDV和抗ALV-J的单克隆抗体细胞株是由以下方法分别制备的:分别用原核表达MDV囊膜糖蛋白gB的重组质粒PET-28a-gB和原核表达ALV-J囊膜糖蛋白gp85的重组质粒PET-28a-gp85转化大肠杆菌BL-21,挑选阳性克隆菌株;摇菌培养后用IPTG诱导蛋白表达,菌液上清经超声波裂解后过镍柱纯化,分别得到纯化的MDVgB表达蛋白和ALV-Jgp85表达蛋白;将纯化的gB表达蛋白和gp85表达蛋白分别以2030ug/只的剂量用福氏佐剂乳化,制备免疫原免疫6周龄Balb/c系小鼠两组,每组免疫三次,每次间隔1530d;最后一次加强免疫后34d,分别将两组免疫鼠眼球放血,拉颈处死后置于75%(V)的酒精溶液中浸泡510min,无菌摘取免疫鼠的脾脏,剪碎并经100目尼龙网过滤,用GNK洗液混悬脾细胞,1000r/min离心10min,收集脾细胞;将每组收集的免疫鼠的IXIO8个脾细胞分别与2XIO75XIO7个NSO骨髓瘤细胞混合,再用GNK洗液混悬稀释至总体积为40ml,1000r/min离心10min,弃上清,分别将两种混合细胞沉淀置于37°C水浴中,-1500,边加边轻轻摇晃,然后再分别缓慢加入GNK洗液15ml,37°C水浴5min,最后补足GNK洗液至总体积为40ml,1000r/min离心10min,弃上清;将两种细胞沉淀分别重悬于1640/HAT选择培养基中,最后以200ML/孔分别铺板至96孔培养板,置于37°C、5%的CO2培养箱中培养710d,杂交瘤的培养上清分别用间接免疫荧光试验检测,挑选荧光较强的细胞克隆,分别用有限稀释法连续进行三次细胞亚克隆,最后分别筛选获得特异性抗MDV和抗ALV-J的单抗杂交瘤细胞株。所述GNK洗液是由以下方法制备的:称取NaCl24g、、、、葡萄糖6g、,混合后加双蒸水至3000ml,115。。灭菌15min。本发明的有益效果:(I)本发明根据ELISA的基本原理,用免疫层析试纸检测病毒,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,将抗原-抗体反应由ELISA的传统液相环境转到固相滤膜上快速进行,并采用胶体金印迹代替酶印迹,凭肉眼直接观察胶体金的显色状况,即时获得检测结果,因此该方法比ELISA等血清学方法更为简便、快速。(2)检测特异性强,敏感性高。该试纸条以胶体金印迹高亲和力的特异性单抗或多抗为基础制备而成,金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成,二者通过异性电荷间的范德华力相结合,胶体金标对单抗或多抗特异性和亲和力(结合力)影响很小,且具有较高的印迹率。(3)操作简便,快速。试纸条可以一次同时进行MDV病毒和ALV-J病毒的检测,大大节省检测时间和检测费用,提高工作效率。使用时只需将测试端插入待检样品液中30s左右,在I5min内即可判定检测结果。(4)结果显示直观、准确。试纸条以显示两条棕红色的检测印迹Tl和T2以及一条对照印迹C作为检测的阳性和质控印迹,即在纤维素膜上显示三条棕红色印迹T1、T2和C,表示MDV和ALV-J均在被检测样品液中被检出,结果为双阳性;在纤维素膜上显示一条棕红色的检测印迹Tl或T2以及一条对照印迹C,表示只有相对应的MDV或ALV-J的一种病毒在被检测样品液中被检出,结果为单阳性;在纤维素膜上只显示一条棕红色对照印迹C,表示两种病毒均在被检测样品液中未检出,结果为阴性。结果判定直观、准确,简单明了,不易出现假阴性和假阳性的误判。(5)减少投资和检测成本。使用该试纸条不需另配其它仪器、设备和试剂,节省大量仪器、设备和附加试剂费用,专业和非专业人士均可随时随地进行现场检测,无需支付专家诊断检查费或送样品去诊断室的路费,节省检测成本。使用该试纸条检测每份样品仅需人民币35元,比用通常的仪器分析(每份样品300元左右)和进口ELISA试剂盒(每份样品30元左右)的检测费大幅下降。(6)应用范围广,便于普遍推广。本发明操作简单,成“一步式”或“傻瓜式”操作,而且方便携带和保存,能满足不同层次人员的需要,包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖和个体养殖等,具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。图1为本发明试纸条的俯视结构示意图。图2为图1试纸条的侧面结构示意图。图中,I为支撑层,2为样品吸附纤维层,3为金标抗体纤维层,4为纤维素膜层,5为吸水层,6-1为MDV检测印迹,6-2为ALV-J检测印迹,7为对照印迹,8_1为测试端保护膜,8-2为手柄端保护膜,9为印迹线。具体实施例方式实施例1:一种一步法快速检测马立克氏病病毒MDV和J亚群禽白血病病毒ALV-J的试纸条,参见图1、图2。支撑层I以塑胶薄片条制成,样品吸附纤维层2以玻璃棉制成,金标抗体纤维层3上附着有胶体金标记的抗MDV、抗ALV-J的两种单克隆抗体的玻璃棉制成的混合金标抗体,纤维素膜层4用***纤维素制成,吸水层5为由吸水滤纸制成,将编号2、3、4、5各层依次粘贴在支撑层I上,彼此拼接的交界处纤维互相交叉渗透。在纤维素膜层4上设有抗MDV和抗ALV-J的两种多克隆抗体IgG溶液分别标记的MDV检测印迹6_1和ALV-J检测印迹6-2(代号分别为Tl和T2),以及以羊(或兔)抗小鼠IgG溶液标记的对照印迹7(代号C);两检测印迹与对照印迹的排列形式为“III”。测试端保护膜8-1覆盖在样品吸附纤维层2和金标抗体纤维层3上面,为白色;测试端保护膜8-,印迹线9的右端印有箭头及MAX字样,吸水层5上覆盖有其它颜色(如黄色或蓝色)的手柄端保护膜8-2。用于对照印迹的羊(或兔)抗小鼠IgG抗体,及用于检测印迹和金标抗体纤维层的抗MDV和抗ALV-J的多克隆抗体和单克隆抗体的制备方法如下:(I)羊(或兔)抗小鼠IgG的制备以饱和硫酸铵法提取小鼠血清中的IgG:取I份血清加2

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