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除草剂抗性植物的制作方法.docx


文档分类:高等教育 | 页数:约79页 举报非法文档有奖
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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。除草剂抗性植物的制作方法专利名称:除草剂抗性植物的制作方法技术领域:本发明涉及重组DNA技术,且特别是当与非转基因样植物比较时对除草剂显示实质(Substantial)抗性或实质耐性的转基因植物的制备。对除草剂具有实质“耐性”的植物当受试于除草剂时,与同样受试于除草剂的非耐性样植物相比提供了右移的剂量/反应曲线。该剂量/反应曲线具有绘于x-轴上的“剂量”和绘于y-轴上的“杀死百分比”、“除草效应”等。为了产生拟定的除草效应,耐性植物较非耐性样植物将需要更多的除草剂。对除草剂具有实质“抗性”的植物当以农业化肥团体一般用于杀死田间杂草的浓度和速率受试于除草剂时,如果有的话,也显示出极少的坏死、裂解、萎黄病或其它损伤。对除草剂具有抗性的植物也对该除草剂具有耐性。在本申请的上下文里将术语“抗性”和“耐性”解释为“耐性和/或抗性”。根据本发明提供了这样的多核苷酸,其至少包括编码能够赋予植物或形成该植物的组织对第一种除草剂抗性或耐性的第一种蛋白的第一个区域,和编码同样能够赋予对第二种除草剂抗性的第二种蛋白的第二个区域,并具有以下的附加条件(ⅰ)该多核苷酸不编码包括仅仅5-烯醇-***酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白;(ⅱ)该多核苷酸不包括仅仅编码超氧物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S转移酶(GST)的区域;和(ⅲ)该多核苷酸不包括仅仅编码GST和膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)的区域。在本发明优选的实施方案中,由该多核苷酸所包括的区域每个均在植物可操作启动子和终止子的表达控制之下。这样的启动子和终止子对技术人员是众所周知的,他们可根据其特定的需要挑选启动子及终止子。例如,适宜的启动子包括35SCaMV或FMV启动子以及拟南芥菜和玉米泛素的启动子。优选地,这些启动子为组成性的。这避免了外部诱导并且意味着该植物对每种相应的除草剂永久具有耐性或抗性。编码除草剂抗性基因的DNA也可在可诱导启动子的控制下包括进植物转化载体中以在该转基因植物中得到可诱导的除草剂抗性。这样的启动子包括可化学诱导的已知的GST-27启动子,借此通过施加适宜的诱导物(如化学安全剂)可开启抗性。在有些情况中,该仅在需要时表达或增加对除草剂抗性的能力可能是优越的,例如,在作物轮作期间,第一种作物的一些个体可能在下一年在待种植第二种作物的田间生长。除草剂可用于毁坏这些未被诱导并且仍为易感的“自生自长”植物。仅仅需要除草剂抗性时(即,就在应用除草剂之前)除草剂抗性基因表达的诱导也可能在有些情况中在代谢上更为有效,因为那时植物仅在需要时产生抗性多肽。适宜的可诱导启动子进一步包括可诱导的四环素启动子、细菌lac阻遏物/操纵子系统、与地塞米松一起的糖皮质激素受体、可诱导的铜和水杨酸启动子、/2334中所述的所谓Alc启动子。在本发明特别优选的实施方案中,至少由该肽所包括的区域中至少其中一个提供对出苗前除草剂的抗性并且至少这些区域中另一个提供对出苗后除草剂的抗性。同时技术人员无需对出苗前和出苗后的定义,“出苗前”意为在萌发的种子出现于土表以上之前施用,即在土地之上可见到任何植物材料之前施用。出苗后意为在土表之上可见到幼苗之后施用。出苗前的除草剂可选自二硝基苯***除草剂、除草定、flupoxam、毒莠定、***咯草***、四唑啉***包括N-氨甲酰四唑啉***、如在EP-A-612,735中所述的那些物质、sulcatrione、达草伏、RP201772、阿特拉津或别的三嗪、亚氨基噻重氮(iminothiadozole)、diflufenicon、磺酰脲、咪唑啉***、硫代氨基甲酸酯、三嗪、尿嘧啶、尿素、三***、异噁唑、乙酰替苯***、噁二唑、EP-A-511,826中所述的二氧磷基磺酸酯类除草剂、三嗪***、磺酰苯***(sulfonanilide)、酰***、羟乙酰***(oxyacetamides)如fluthiamide、N-酰苯***(anilide)和三唑啉***型除草剂。三***类除草剂的实例包括2-(2-硝基-4-三******苯甲酰基)-环己烷-1,3-二***。2-(2-***-4-甲烷磺酰苯甲酰基)-环己烷-1,3-二***,2-(2-2-硝基-4-甲烷磺酰苯甲酰基)-环己烷-1,3-二***,〔5-环丙基4-(2-甲磺酰基-4-三******苯甲酰基)异噁唑,等。为了避免疑惑,“三***类除草剂”意为能够抑制4-羟苯基***酸盐(或***酸)双加氧酶(HPPD)的任何化合物。在本发明上下文里,术语4-羟苯基***酸盐(或***酸)双加氧酶(4-HPPD)和p-羟苯基***酸盐(或***酸)双加氧酶(p-OHPP)为同义的。出苗后除草剂可选自镇草宁及其盐、glufosinate、二苯醚、磺草灵、灭草松、bialaphos、除草定、稀禾定或别的环己烷二***、麦草畏、fosamine、flupoxam、苯氧丙酸、喹禾灵或别的芳氧基-苯氧丙酸酯、毒莠定、伏草隆、阿特拉津或别的三嗪、metribuzin、***嘧黄隆、绿黄隆、flumetsulam、halosulfuron、嘧黄隆、灭草喹、咪草烟、isoxaben、imazamox、metosulam、pyrithrobac、rimsulfuron、苄嘧黄隆、烟嘧黄隆、***黄***草醚、fluroglycofen、KIH9201、ET751、carfentrazone、carfentrazone、ZA1296、ICIA0051、RP201772、flurochloridone、达草灭(norflurazon)、百草枯、敌草快、溴苯***和恶唑禾草灵。本发明多核苷酸能够赋予对其抗性(或本发明植物对其具有抗性或耐性的)这些除草剂的特别优选的组合为(ⅰ)镇草宁和二苯醚或乙酰N-酰苯***型除草剂;(ⅱ)镇草宁和/或glufosinate和N-酰苯***和/或三唑啉***型除草剂;(ⅲ)三***和镇草宁和/或glufosinate;(ⅳ)镇草宁和/或glufosinate和三***及N-酰苯***型除草剂;(ⅴ)镇草宁和/或glufosinate和PDS抑制剂(如下述化学式Ⅰ-Ⅲ的化合物)。由该多核苷酸所述区域所编码的蛋白可选自镇草宁氧化-还原酶、5-烯醇-***酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)、膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)、羟苯基***酸双加氧酶(HPPD)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、细胞色素P450、乙酰-COA羧化酶(ACC)、乙酰乳酸合酶(ALS)、原卟啉原(protoporphyrinogen)氧化酶(protox)、dihydropteroate合酶、多***转运蛋白、超氧物歧化酶(SOD)、溴苯***水解酶(bromoxynilnitrilase)(BNX)、八氢番茄红素脱氢酶(PDS)、可从真氧产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)获得的tfdA基因的产物以及所述蛋白已知的诱变或其它修饰变异体。所述的tfdA基因的产物为能够氧化苯氧羧酸,如2,4-D成为相应的酚。,090中所述的所谓Ⅱ类EPSPS。作为选择、和/或此外,可对其进行突变从而在特定位置包括已知导致对镇草宁(和其农业上可接受的盐)增强抗性的氨基酸替代。例如,相对于在SEQIDNO:9中所述的EPSPS,该EPSPS可至少在相应于174、178、173和264位置处具有残基Thr、Pro、Gly和Ala,变化如下(ⅰ)Thr174-Ile(ⅱ)Pro178-Ser(ⅲ)Gly173-Ala(ⅳ)Ala264-Thr其中(ⅰ)Thr174在邻接包括Ala-Gly-Thr-Ala-Met的序列内发生;(ⅱ)Pro178在邻接包括Met-Arg-Pro-Leu-Thr的序列内发生;(ⅲ)Gly173在邻接包括Asn-Ala-Gly-Thr-Ala的序列内发生;并且(ⅳ)Ala264在邻接包括Pro-Leu-Ala-Leu-Gly的序列内发生。此外,在相应于跨越SEQIDNO:9中位置192到232的EPSPS酶区域中的基序Glu-Arg-Pro-AA1-AA2-Leu-Val-AA3-AA4-Leu-AA5-AA6-AA7-Gly中的末端Gly残基可用Asp或Asn残基替代。在该多核苷酸的一个实施方案中,编码HPPD的区域具有描述于SEQIDNOs:1或3中的序列,或者作为选择与这样的序列互补,即该序列当于60和65℃%%:1或3中所描述的序列杂交。当测试和发明序列为双链时,构成测试序列的核酸TM优选与所述的SEQIDNO:1序列TM相差在15℃以内。当测试和SEQIDNO:1序列(或测试和SEQIDNO:3序列)混合到一起并同时变性时,这些序列相互间TM值差异优选在5℃以内。更为优选地,杂交在相对严格的条件下进行,优选支持测试或发明序列。这样,将或者是变性的测试序列或者是变性的发明序列优选首先结合到支持物上并且在60和65℃%。杂交包括本发明序列的地方,杂交条件也可以较少严格,这些对于技术人员都是显而易见的。当该多核苷酸包括能够赋予对三***类除草剂抗性的HPPD基因时,以该多核苷酸转化的植物材料可受试于三***类除草剂并且当受试于所述的除草剂时根据转化和未转化材料之间的颜色差异用视觉加以筛选。因此,当受试于此筛选方法时未转化的材料可变成和维持白色,而当受试于所述的筛选方法时,转化的材料可能变白但后来变成绿色,或可能维持绿色样的颜色。本发明多核苷酸的进一步实施方案包括编码能够提供给植物对昆虫、脱水和/或真菌、细菌或病毒感染抗性或耐性的蛋白的进一步区域。由该区域所编码的蛋白对技术人员是已知的并且包括,例如,来自苏云金杆菌的Δ内***和来自病毒的包被蛋白。该多核苷酸可以包括所述区域的5′及与其邻接的序列,这些序列编码(ⅰ)能够靶向该区域的翻译产物至质体如叶绿体、线粒体,其它细胞器或植物细胞壁的肽;和/或(ⅱ)非翻译的翻译增强序列。适宜的靶向序列编码叶绿体转运肽,特别是在紧临其下游的赋予对除草剂抗性的区域为EPSPS或GOX酶时更是如此。编码该多核苷酸中含有序列的蛋白的翻译表达可通过包括此所述蛋白编码区5′已知的非翻译的翻译增强序列而得到相对增强。技术人员对这种增强序列非常熟悉,包括称为Ω的来源于TMV的序列和Ω引物(prime)以及特别是可从其它病毒包被蛋白编码序列,如烟草蚀刻病毒5′区域得到的其它序列。至于核苷酸序列在植物体内(inplanta)的表达,修饰编码能够赋予对除草剂抗性已知蛋白的序列也许是合意的。因此,本发明也包括如上所述但mRNA不稳定性基序和/或偶然发生的剪切区域,或者使用植物优选的密码子因而被修饰的被除去多核苷酸从而这样修饰的多核苷酸在植物中的表达产生与通过该未修饰多核苷酸在有机体中表达而获得的蛋白具有基本上(substantially)类似活性/功能的基本上类似的蛋白,其中该未修饰多核苷酸的蛋白编码区对该有机体是内源性的,该多核苷酸具有以下的附加条件,即如果这样修饰的多核苷酸包括植物优选的密码子,那么在该修饰多核苷酸内的蛋白编码区与所述植物内源性含有的并编码基本上相同蛋白的同样的蛋白编码区之间的相同程度小于约70%。本发明进一步包括含有所述多核苷酸的载体。本发明更进一步提供包括至少2种编码能够赋予对至少2种除草剂抗性蛋白的核苷酸序列并且从以本发明多核苷酸或载体转化的材料中再生出的植物。转化技术是众所周知的并且包括粒子介导的biolistic转化、农杆菌-介导的转化、(任选在聚乙二醇存在下的)原生质体转化;在包括该多核苷酸培养基中的植物组织细胞或原生质体的超声破碎;(任选利用已知的碳化硅“whiskers”技术的)显微插入该多核苷酸到全能植物材料中,电穿孔等。转化的发明植物包括小型谷物(smallgraincereals)、油料种子植物、纤维植物、果树、蔬菜、种植作物及树木。特别优选的这样的植物包括大豆、棉花、烟草、甜菜、油菜、canola、亚麻、向日葵、土豆、番茄、苜蓿、莴苣、玉米、小麦、高粱、黑麦、香蕉、大麦、燕麦、草皮草、料草、甘蔗、豌豆、蚕豆、水稻、松树、杨木、苹果树、葡萄、柑桔或栗树以及这些植物的后代、种子及一部分。本发明进一步提供包括含有编码至少2种能够赋予该材料对至少2种除草剂抗性蛋白区域的核酸的植物材料,其具有以下的附加条件,即该材料不包含编码包括仅仅5-烯***-***酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白的多核苷酸;(ⅱ)该材料不包含包括仅仅编码超氧物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S转移酶(GST)区域的多核苷酸;(ⅲ)该材料不包含包括仅仅编码GST和膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)区域的多核苷酸;和(ⅳ)当该材料的来源植物为甜菜时,其包括的赋予对除草剂抗性或耐性的基因不仅仅是EPSPS和PAT。通过对于技术人员已知的方法,该材料可再生成形态上正常且可育的完整植物。在该材料的优选实施方案中,至少其中的一个区域编码能够赋予对出苗前型除草剂抗性的蛋白,并且至少其中的另一个区域编码能够提供对出苗后型除草剂抗性的蛋白。这样的蛋白编码区域及除草剂已在上面讨论过。技术人员将认识到,由于包括编码能够赋予对第一种除草剂抗性的第一种蛋白多核苷酸的第一种植物与包括编码能够赋予对第二种除草剂抗性的第二种蛋白多核苷酸的第二种植物杂交,赋予对多种除草剂抗性的区域可存在于植物(或其一部分)中(参见本申请的实验部分)。赋予对除草剂抗性基因的优选组合为(ⅰ)HPPD基因和EPSPS或GOX基因;(ⅱ)HPPD基因和PAT基因;(ⅲ)GST基因和EPSPS/GOX基因;(ⅳ)EPSPS/GOX基因和PAT基因;(ⅳ)HPPD基因、GOX和/或EPSPS基因,和PAT基因;(ⅴ)ACC′ase基因和PAT和/或EPSPS基因;(ⅵ)PDS基因和PAT和/或EPSPS和/或GOX基因;(ⅶ)可从真氧产碱杆菌获得的tfda基因与EPSPS和/或GOX和/或PAT和/或PDS基因。此外,这些组合中的每一种可具有一个或更多个由SOD、protox和/或ALS基因所替代的除草剂基因这样的植物在本申请中称为本发明的植物。本发明也包括选择性控制包括杂草和作物植物的大田间杂草方法,其中的作物植物包括(ⅰ)这样的多核苷酸,其至少包括编码能够赋予植物或形成该植物的组织对第一种除草剂抗性或耐性的第一种蛋白的第一个区域和编码同样能够赋予对第二种除草剂抗性的第二种蛋白的第二个区域,其具有以下附加条件(ⅰ)该多核苷酸不编码包括仅仅5-烯醇-***酰

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