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肠道菌群失调对内脏敏感性的影响及其机制.docx


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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。肠道菌群失调对内脏敏感性的影响及其机制??邵珲,王进海,张杰,杨龙宝,谢丹红(西安交通大学医学部第二附属医院:,陕西省肠胃动力疾病研究重点实验室,陕西省胃肠疾病临床研究中心;,陕西西安710004)◇基础研究◇肠道菌群失调对内脏敏感性的影响及其机制邵珲1,王进海1,张杰2,杨龙宝1,谢丹红1(西安交通大学医学部第二附属医院:,陕西省肠胃动力疾病研究重点实验室,陕西省胃肠疾病临床研究中心;,陕西西安710004)目的检测肠道菌群失调大鼠的内脏敏感性变化及紧密连接蛋白(ZO-1)、Toll样4受体(TLR4)的表达,探讨肠道菌群失调对内脏敏感性的影响及其机制。方法SPF级SD大鼠30只,随机分为正常对照组(12只)、菌群失调组(18只)。菌群失调组采用盐酸林可霉素(300mg/mL)灌胃,1mL/(次·只),1次/d,连续给药7d;正常对照组采用等量生理盐水灌胃。第8天随机抽取菌群失调组和正常对照组大鼠各6只,检测模型是否成功。模型建立成功后,将其余12只菌群失调组大鼠随机分组:阴性对照组、益生菌干预组,每组6只。益生菌干预组给予双歧杆菌三联活菌胶囊(培菲康)灌胃,1粒/3mL生理盐水,1mL/(次·只),1次/d,连续给药7d;阴性对照组给予同等量生理盐水灌胃。第8天进行粪便菌群培养、检测内脏敏感性、检测结肠组织中ZO-1及TLR4的mRNA和蛋白表达、检测血清中炎性因子IL-10、TNFα的表达。结果与正常对照组比较,菌群失调组大鼠结肠ZO-1的mRNA含量及蛋白表达显著降低,而结肠TLR4的含量及蛋白表达显著升高,且血清中促炎因子TNFα表达显著升高,而抑炎因子IL-10的表达显著降低(P<)。与菌群失调组相比,益生菌干预组结肠ZO-1的mRNA含量及蛋白表达显著升高,而结肠TLR4的mRNA含量及蛋白表达显著降低,且血清中促炎因子TNFα表达显著降低而抑炎因子IL-10的表达显著升高(P<)。结论通过抑制结肠中ZO-1的表达及升高TLR4的表达,进而导致慢性低度炎症的发生可能是肠道菌群失调导致内脏高敏感的作用机制之一,同时益生菌制剂可能通过恢复肠道菌群变化进而改善内脏高敏感。肠道菌群失调;内脏高敏感;肠易激综合征;低度炎症;紧密连接蛋白(ZO-1);Toll样4受体(TLR4);益生菌肠易激综合征(irritablebowelsyndrome,IBS)是以腹痛或者腹部不适伴排便****惯或大便性状改变为特征,症状持续或间歇发作,经相关检查无器质性病变证据的综合征。IBS发病机制复杂,其中内脏高敏感是其最主要的病理机制之一[1],也是评价IBS造模成功与否的重要标志。近年来,研究发现肠道菌群失调在IBS的发生发展中起了重要作用[2-4]。目前,有学者发现IBS患者原来稳定的肠道菌群出现紊乱会影响感觉功能和内脏敏感性[5-8],部分IBS患者肠黏膜中存在低度炎症[1,9-11],而肠道菌群改变导致的感觉异常又由变化的生理性炎症所调节,故其提议将“肠道菌群失调—肠道低度炎症—内脏高敏感”建立在一个新的概念模型里[10],但尚没有学者去验证这一想法。因此,本课题建立了肠道菌群失调大鼠模型,通过观察菌群失调组大鼠结肠中紧密连接蛋白(tightjunctionprotein,ZO-1)、Toll样4受体(Tolllikereceptor4,TLR4)的表达水平,及血清中促炎因子TNFα、抑炎因子IL-10的表达水平,探索肠道菌群对内脏敏感性的影响及可能的调控机制,从而为IBS的发病机制提供一个新的理论依据,为IBS的治疗及药物研发提供新的思路。、试剂及仪器SPF级雄性SD大鼠30只,体质量180~220g,西安交通大学医学部实验动物中心提供。德国Braun8F导尿管;数字显示隔水式电热恒温培养箱,西安交通大学实验室提供;法国BioMerieux厌氧培养袋;双歧三联活菌胶囊(培菲康)购自上海信谊药厂有限公司;Trizol、PrimeScriptRTMasterMix试剂盒、SYBRPremicExTaqⅡ试剂盒均购自日本TaKaRa公司;美国Bio-red公司荧光定量PCR仪;冷冻离心机(北京时代);兔抗大鼠ZO-1抗体购自武汉博士德生物技术有限公司;兔抗大鼠TLR4抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;SP免疫组化试剂盒及DAB显色剂试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;日本Olympus光学显微镜;大鼠TNF-αELISA试剂盒、大鼠IL-10ELISA试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。,随机分为正常对照组(12只)、菌群失调组(18只)。分笼饲养,每笼6只,适应饲养环境1周后,采用盐酸林可霉素(300mg/mL)灌胃建立肠道菌群失调大鼠模型[12],1mL/(次·只),1次/d;正常对照组采用等量生理盐水灌胃。连续给药7d,第8天随机抽取正常对照组及菌群失调组大鼠各6只,观察大鼠一般行为,取新鲜粪便进行菌群培养[13],用腹部回撤反应(abdominalwithdrawalreflex,AWR)检测内脏敏感性[14],并处死取结肠组织以检测ZO-1及TLR4的mRNA和蛋白表达,取静脉血以检测血清中炎性因子IL-10、TNFα的表达。模型建立成功后,将其余12只菌群失调组大鼠随机分为阴性对照组、益生菌干预组,每组6只。益生菌干预组给予培菲康1粒溶于3mL生理盐水中灌胃,1mL/(次·只),1次/d;阴性对照组给予同等量生理盐水灌胃。7d后同样观察大鼠的一般行为,粪便菌群培养,检测内脏敏感性及ZO-1、TLR4的mRNA和蛋白表达,检测血清中IL-10、TNFα的表达。,,按10倍连续稀释法用无菌生理盐水稀释至10-8,取10-4、10-5、10-6稀释液各50μL分别接种在选择性培养基上。选择性培养基分别为肠杆菌(EMB)、肠球菌(EF)、双歧杆菌(BS)、乳酸杆菌(LBS)。肠杆菌及肠球菌于需氧环境下,37℃培养24~48h,双歧杆菌及乳酸杆菌于厌氧环境下37℃培养48h。观察结果以每克粪便中菌落形成单位的对数值表示(logCFU/g),并计算双歧杆菌和肠杆菌的比值(B/E值)代表肠道定植抗力[3]。公式:logCFU/g(mL)=同一稀释度3次重复的菌落平均数×稀释倍数/接种体积(mL)[15]。:0分,大鼠对结直肠扩张无行为学反应;1分,结直肠扩张时身体静止不动,头部运动减少;2分,结直肠扩张时腹肌轻微收缩,但腹部未抬离桌面;3分,结直肠扩张时腹肌明显收缩并且腹部抬离桌面;4分,结直肠扩张时腹肌强烈收缩,骨盆抬起,身体呈弓形。AWR是一种半定量指标,为尽可能减少主观误差,本实验以AWR评分3分时球囊容量作为容量阈值[14]。检测前禁食24h、不禁水,将清醒状态下的大鼠放入固定器内,限制大鼠的各项活动,但能观察到腹壁收缩。将Braun8F气囊导尿管外涂石蜡油后经肛门插入,导管末端距肛门1cm,用胶布将导尿管固定于大鼠尾根部。15min后大鼠适应环境呈安静状态,经导尿管外口向球囊内注入常温水(26~28℃生理盐水)扩张,记录大鼠出现AWR评分各分值时所需的最小注水量为最小容量阈值。重复扩张3次,每次间隔15min,3次扩张数据均值作为该鼠直肠扩张引起AWR的最小容量阈值。休息30min,、、,每次间隔15min。用引起大鼠AWR的最小容量阈值和直肠内球囊不同容量扩张时1min内大鼠腹部收缩反射的次数,评价大鼠对直肠内扩张刺激的内脏敏感性[14]。-timePCR测定结肠组织ZO-1、TLR4的mRNA表达水平①RNA提取及引物的设计合成。引物设计及合成由奥科鼎盛生物公司完成:ZO-1上游引物:AATGAATGATGGTTGGTATGG,下游引物:TGACAGGTAGGACAGACG;TLR4上游引物:AAGTTATTGTGGTGGTGTC,下游引物:CTGCTAAGAAGGCGATAC;内参β-actin上游引物:CTATCGGCAATGAGCGGTTC,下游引物TGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG。②逆转录反应。取2μLRNA模板做逆转录反应,反应体系如下:5×PrimeScriptRTMasterMix4μL,模板RNA2μL,RNasefreedH2O14μL。其中5×PrimeScriptRTMasterMix含有RTase,RNaseInhibitor,OligodTPrimer,Random6mers,dNTPMixture和反应buffer。反应条件:37℃15min,然后85℃5s,降至4℃。③RT-PCR反应。反应体系及条件:SYBR?PremixExTaqⅡ(2×)10μL,PCR上游引物(10μmol/L),PCR下游引物(10μmol/L),,DH2O(steriledistilledwater)。总体积为20μL。其中SYBRPremixExTaqⅡ含有ExTaqHS,dNTP,Mg2+,TliRNaseH和SYBR?GreenI。反应条件:95℃30s1个循环;95℃5s,60℃20s40个循环;95℃0s,65℃15s,95℃0s。反应结束后由电脑自动得出荧光曲线及CT值,采用2-△△CT计算出ZO-1、TLR4的相对表达量。TLR4蛋白的免疫组织化学方法同上,一抗(TLR4)稀释浓度为1∶300。显微镜观察,拍照。组织切片均以细胞质和(或)细胞膜出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性,用计算机图像分析系统计算蛋白表达的阳性面积。-10、TNFα的表达水平严格按照试剂盒说明书进行操作。。计量资料以表示,所有数据均进行正态性检验和方差齐性检测,满足正态分布及方差齐性后,各组之间的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。P<。,菌群失调组大鼠精神状态略显萎靡、反应迟钝、毛色光泽度降低、摄食减少,且大便较稀;益生菌干预组大鼠较模型组大鼠各方面状态较好;而阴性对照组大鼠各方面一般情况不如益生菌干预组,但好于菌群失调组。:各组大鼠结肠组织的黏膜结构完整,均无充血、水肿、溃疡形成;常规HE染色显微镜下观察正常对照组及益生菌干预组结肠组织的黏膜形态完好,上皮细胞排列整齐,炎症细胞很少,无上皮细胞坏死、糜烂等;菌群失调组及阴性对照组的黏膜层及黏膜下层可见少量炎症细胞,组织稍充血,但腺体排列尚整齐,无上皮细胞坏死、糜烂等(图1)。(HE,×40),与正常对照组相比,菌群失调组的有益菌即双歧杆菌(BS)、乳酸杆菌(LBS)明显减少(P<),而条件致病菌即肠杆菌(EMB)明显增多(P<),肠道定植抗力(B/E值)<1(P<);益生菌干预组相比菌群失调组而言,肠道菌群有所恢复,表现为BS、LBS明显升高(P<),EMB明显减少(P<),B/E值>1(P<);阴性对照组的4种肠道细菌含量与菌群失调组相比,EMB、BS无明显差异(P>),但EF、LBS相比有统计学差异(P<),说明阴性对照组的大鼠肠道菌群还是有部分恢复的。菌群培养见图2~图4。随着与城镇及工矿用地的距离增加各项指标均有不同程度的减小,但趋势各不相同。%,%,农村居民点平均面积与标准差显著高于其他区域,表明城镇与工矿用地对于农村居民点的规模特征有较大的影响。城镇是区域发展的经济中心,聚集着区域大量的人口与公共服务,对农村居民点产生较强的吸引。工矿用地所需大量劳动力且为农村居民带来的经济效应高于农业耕作,因此影响着农村居民点的形成与发展。各区域内农村居民点数量、斑块密度、景观形态指数及形状指数差异并不明显,表明城镇及工矿用地对于农村居民点的数量分布及其形态影响程度相对较低。/Eindifferentgroups()表1不同组别粪便培养菌落总数及B/()与正常对照组相比,*P<;与菌群失调组相比,#P<。,与正常对照组相比,菌群失调组有较高内脏敏感性(P<);益生菌干预组与菌群失调组相比,内脏敏感性有所缓解(P<);阴性对照组与菌群失调组比较,内脏敏感性有所降低(P<),但与正常对照组相比仍有差异(P<),说明阴性对照组的大鼠内脏敏感性有所恢复,但尚未达到正常。、、,,部分大鼠出现腹壁强直收缩,无法统计收缩次数,。,腹壁收缩次数明显高于另外3组(P<);益生菌干预组与正常对照组、阴性对照组相比均无统计学差异(P>),内脏敏感性有所恢复;阴性对照组与菌群失调组相比,内脏敏感性有所恢复(P<)。()()与正常对照组相比,*P<;与菌群失调组相比,#P<。-1、TLR4的mRNA的表达水平Real-timePCR结果显示,各组大鼠的结肠组织均有ZO-1mRNA的表达。与正常对照组相比,菌群失调组的ZO-1mRNA表达明显减少(P<);与菌群失调组相比,益生菌干预组的ZO-1mRNA表达明显增多(P<);阴性对照组与菌群失调组相比,ZO-1mRNA表达有所增多,较正常对照组还是减少的,但均无明显统计学差异(P>,表3)。各组大鼠的结肠组织均有TLR4mRNA的表达。与正常对照组相比,菌群失调组的TLR4mRNA表达明显增多(P<);与菌群失调组相比,益生菌干预组的TLR4mRNA表达明显减少(P<);阴性对照组与菌群失调组相比,TLR4mRNA表达有所降低,较正常对照组还是有所增多的,但均无统计学差异(P>,表3)。表3各组ZO-1mRNA、-1mRNAandTLR4mRNAineachgroup()

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