核酸的序列测定
第五章
易发平
基础医学院生物化学与分子生物学教研室
DNA的测序是分子生物学研究中非常重要和关键的内容。对DNA一级结构的研究,有助于探索基因结构与功能、基因与疾病关系,进而推动生命科学研究获得质的飞跃。测定基因组的全部核苷酸序列、阅读和分析全部遗传信息,正是人类基因组计划(human genome project, HGP)的最主要目标之一。
将DN***段用荧光等分析仪,测出DNA序列碱基排列顺序。
DNA 序列测定方法:
1. Sanger的双脱氧法:A/T/G/C四个反应。
:G反应;G+T反应;T+C反应和C反应。
。
DNA 测序的主要方法有两种,即双脱氧链终止法(Sanger 法、酶促法)和化学裂解法(Maxam-Gelbert 法)。二者均依赖于高分辨率的变性聚丙烯酰***凝胶电泳(PAGE)。不管是酶促法还是化学法,都是分为4个反应体系进行测序反应,寡核苷酸链分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基。4种反应体系的寡核苷酸链产物,进行变性聚丙烯酰***凝胶电泳,放射自显影后,读出待测DNA的连续序列。
一、 Sanger 双脱氧链终止法
(一)原理(单链)
DNA链中的核苷酸是以3`,5`-磷酸二酯键相连接,合成DNA所用的底物是2`-脱氧核苷三磷酸(dNTP),在Sanger 双脱氧链终止法中被掺入了2`,3`-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),当ddNTP位于链延伸末端时, 由于它没有3`- OH,
不能再与其它的脱氧核苷酸形成3′,5′-磷酸二酯键,DNA合成便在此处终止,如果此处掺入的是一个ddATP,则新生链的末端就是A,依次类推可以通过掺入ddTTP、 ddCTP、 ddGTP ,则新生链的末端为T、C或G,根据这个原理,Sanger与1977年建立了双脱氧链终止测序法。他本人也因此而获得了诺贝尔奖。
Sanger
双脱氧核苷三磷酸
互补链合成过程
以单链或双链DNA为模板,采用DNA引物引导新生DNA的合成,因此又称为引物合成法,或酶促引物合成法。主要是基于DNA聚合酶的催化特性:①以DNA为模板,根据碱基配对的原则逐个将dNTP加到与模板结合的寡核苷酸引物的3′-OH末端,形成正确的模板DNA互补链;②能以dNTP作为底物,也能利用ddNTP作底物,将其掺入寡核苷酸链的3 ′末端而终止新生互补链的延伸。
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