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流式细胞仪用于细胞周期分析
细胞周期生物学基础
细胞的生成依赖于细胞的分裂而产生两个子代细胞的过程。在分裂过程最需要复制并传递给子代细胞的是细胞核,因为它包含了细胞的遗传信息载体-DNA。在绝大多数情况下,一个生物体的每个细胞都含有相等的DNA物质和相同成份的染色体。因此,细胞在分裂前必须复制DNA这样它的子代细胞就能够拥有与父代相同的DNA含量。
细胞由DNA含量增加至分裂,再由它的子代继续复制并分裂,这个过程称之为细胞周期。在细胞周期中最具特征性的阶段是在分裂前的DNA含量增加并达到2倍量的时候,并在此时细胞开始分裂其自身-有丝分裂期。细胞周期中这两个循环步骤通常以一字母来表示:S期(合成期)和M期(有丝分裂期)。
当细胞周期中的S期和M期被定义后,我们可观察到在有丝分裂完成后和DNA合成刚开始之时有短暂的停顿或间隙,同样的停顿或间隙存在于DNA合成期后和有丝分裂开始之时。这两个间隙我们将之命名为G1和G2期。这样整个细胞周期可划分为G1 → S → G2 → M → G1,如下图所示:
图1显示了细胞周期中个环节在流式细胞仪上分析时的图谱特征
当细胞没有进入分裂过程时(我们机体中的绝大部分细胞),它们处于细胞周期的G1期的位置上。因此G1细胞在数量上绝对是居各期细胞之首并在流式图谱上形成最高的信号峰。在G1期细胞中有一群细胞特别安静并且没有进入细胞循环的任何生物学特征,我们称这些细胞为G0期细胞。
一些发生在G1和G2期细胞内的生物过程现还不完全明了。处于G1期的细胞已开始为分裂前的DNA的复制和细胞成长准备许多RNA和蛋白分子。处于G2期的细胞则会修复在DNA复制过程发生的错误并识别出在M期时将DNA平均等分的切割位置。
细胞循环中这些阶段的长度因细胞种类的不同而不同。典型细胞循环中各期的发展时间为:G1期12小时,S期6小时,。
分析和流式细胞术细胞周期分析
流式细胞最初的应用之一便是检测细胞的DNA含量,它可快速将细胞循环中的其它阶段与有丝分裂期区别开来。这些检测是基于对细胞内DNA以化学定量方式的染色(染料着色数量直接与细胞内DNA含量相关)。有相当多的对DNA有高亲合力的染料可用于此应用。而不同的染料与DNA分子结合的位点不同。
现用得最多的两种DNA结合染料是蓝光激发的碘化匹啶(PI)(或偶尔也有用EB)和紫外激发的DAPI和Hoechst染料33342和33258。PI染料是一种插入性的与双链DNA和RNA(当要特异地检测DNA时,经常使用RNAse去除RNA)结合,而DAPI和Hoechst染料仅与DNA的螺旋结构的亚级凹槽结合并与RNA完全没有任何结合。Hoechst 33342是现唯一令人满意的能对活细胞DNA时行染色的染料。其他一些染料在染色前需要破坏细胞膜,故经常使用去污剂或低渗溶液处理或溶剂进行固定(酒精)。
*注意:使用溶剂进行固定(如酒精)经常会引起细胞聚集,详情见分析细胞聚集。
当运用DNA结合荧光染料后,可观察到一个有特征的图谱,那就是由各种细胞组成的一个细胞周期分布图。
当二倍体细胞被化学定量式DNA染料着色后并在流式细胞仪上分析,会观察到一个很“窄”荧光峰。它将出现在以荧光强度为X轴、细胞数量为Y轴的坐标上。因为种种原因G1期细胞具有相同的DNA含量,