酶的分离纯化.ppt

酶的分离纯化
1、酶的提取与分离纯化技术路线
2、细胞破碎
3、酶的提取
4、酶的分离方法
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5、酶的组合分离纯化策略
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6、酶的浓缩、干燥与结晶
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细胞结构与酶分布
酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎
酶提取
酶分离纯化
酶浓缩
酶贮存
动物、植物或微生物细胞
发酵液
离心分离,过滤分离,沉淀分离,层析分离,电泳分离,萃取分离,结晶分离等。
酶的纯化过程,约可分为三个阶段:
(1) 粗蛋白质(crude protein): 采样→均质打破细胞→抽出全蛋白,多使用盐析沉淀法;可以粗略去除蛋白质以外的物质。
(2) 部分纯化(partially purified): 初步的纯化,使用各钟柱层析法。
(3) 均质酶(homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化,可用制备式电泳或 HPLC。
酶分离纯化不同阶段
细胞破碎
许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶,首先需要对细胞进行破碎处理。
1)机械破碎
2)物理破碎
3)化学破碎
4)酶解破碎
JY92-II D超声波
细胞粉碎机
细胞破碎珠
高压细胞破碎机
DY89-I型电动玻璃匀浆机
机械破碎
捣碎法
研磨法
匀浆法
物理破碎
温度差破碎法
压力差破碎法
超声波破碎法
化学破碎
有机溶剂:
甲苯、***
丁醇、***仿
表面活性剂:
Triton、Tween
酶促破碎
自溶法
外加酶制剂法
通过机械运动产生的剪切力,使组织、细胞破碎。
通过各种物理因素的作用,使组织、细胞的外层结构破坏,而使细胞破碎。
通过各种化学试剂对细胞膜的作用,而使细胞破碎
通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用,使细胞外层结构受到破坏,而达到细胞破碎
细胞破碎方法及其原理
酶的提取是指在一定的条件下,用适当的溶剂或溶液处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质,选择适当的溶剂。一般说来,极性物质易溶于极性溶剂中,非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中,酸性物质易溶于碱性溶剂中,碱性物质易溶于酸性溶剂中。
酶都能溶解于水,通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取,有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团,则可用有机溶剂提取。
酶的提取
提高温度,降低溶液粘度、增加扩散面积、缩短扩散距离,增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度,从而增大提取效果。
为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活,在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。
酶的主要提取方法
提取方法
使用的溶剂或溶液
提取对象
盐溶液提取
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用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶
酸溶液提取
PH2~6的水溶液
用于提取在稀酸溶液中溶解度大,且稳定性较好的酶
碱溶液提取
PH8~12的水溶液
用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶
有机溶剂提取
可与水混溶的有机溶剂
用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶
大多数蛋白类酶都溶于水,而且在低浓度的盐存在的条件下,酶的溶解度随盐浓度的升高而增加,这称为盐溶现象。
酶的分离方法
1、沉淀分离
2、离心分离
3、过滤与膜分离
4、层析分离
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5、电泳分离
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6、萃取分离
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