脂质体的制备.pps

实验十五 脂质体的制备
(liposome)在细胞工程技术中的应用及其制备方法。
、冰冻干燥法和冻融法三种不同的方法制备脂质体的方法并了解该技术在细胞工程中的应用。
一实验目的
脂质体(liposome)的制备技术,一般采用超声波法、振荡法、***蒸发法、去污剂透析法、冰冻干燥法和冻融法等。制备方法不同,所得脂质体结构、大小不同,性质和用途也就不同(表15-1)。
二实验原理
种类
制备方法
大小(m)
特性
多层大脂质体(MLV)
***蒸发法、醇醚水法、振荡法、液相快速混合振荡法
~50
易制备,包被物释放速度慢
单层小脂质体(SUV)
直接超声波法、溶剂超声波法、***注射法
~
体积小,适合包被离子、小分子药物等
单层大脂质体(LUV)
递相蒸发法、去污剂(胆酸纳等)透析法、冰冻干燥法
~
适合包被蛋白质、RNA、DN***段、大分子药物及细胞融合
单层巨大脂质体(GUV)
冻融法
5~30
适合包被蛋白质、RNA、DN***段,除菌处理较难
本实验采用超声波法、冻融法、冰冻干燥法三种不同类型的方法,超声波法的原理是:在超声波作用下,磷脂类双亲媒性分子被打碎为分子或分子团,并自动重新排布成类似生物膜的双分子层囊泡。冻融法是在超声波法形成的小脂质体基础上,通过冷冻和融解过程使其破裂,重组为大体积脂质体,在通过透析时膜内外渗透压的变化而膨胀为更大体积的脂质体。冰冻干燥法语原理与冻融法基本一致,只在处理条件上有所不同。

超声波清洗机、光学显微镜、荧光显微镜、荧光分光光度计、漩涡混合器、核酸蛋白检测仪、柱层析装置、冰冻干燥机。

1)磷脂液:100mg经***-***法纯化的卵磷脂,,溶于1ml***仿。
2)荧光液:钙黄绿素(calcein)47mg溶于100ml Tris缓冲液。
3)Tris 缓冲液:称取Tris ,EDTA ,溶于80ml去离子水中, mol/,再加水至100ml。
三实验用品
4)2%叠氮钠液。
5)透析液:,加入143ml荧光液中,再加无离子水至1000ml,同时加入10ml叠氮钠液。
6)10m mol/L***化钴液。

,真空干燥20min,再加入荧光液530μl及液530μl,充氮气、封口、漩涡混合器混匀,与超声波清洗机中处理处理10min(电流200~300mA),所得液体即为单层小体积脂质体(SUV)。
四实验步骤
直径分配率计算:取16μl适当稀释的脂质体液(一般稀释100倍)加在载玻片上,盖上盖玻片,并用凡士林封口,用目微尺观测5个视野里的脂质体直径,记录,按下式计算直径分配率D。
D=[X1(0~)+X2(~)×2+X3(~)×3+…]/N
其中X1为5个视野里0~,N为视野数5。
包被率计算:取15μl脂质体液稀释液于2985μlTris液中,在荧光分光光度计上测量荧光强度(A);加入12μlCoCl2液,静置5min,使脂质体外的荧光猝灭,测量膜内荧光强度值(B);加入150μl 10%Triton X-100破膜液,破膜5min,再测量荧光强度(C)。
包被率=(B-C)/(A-C)
其中A为总荧光强度,B为脂质体荧光强度,C为本底荧光强度。