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实时定量PCR:影响CT的关键因素
摘要: 实时定量PCR(real-time PCR),通常也称为定量PCR或qPCR,为确定模板中目标序列或目标基因的量提供了一种简单且优雅的方法。它的简单有时也会带来问题,那就是忽视其中起作用的一些关键因素。来自Applied Biosystems的这篇综述将会强调在建立和评估实时定量PCR反应时必须考虑的这些因素。
影响CT值的因素
CT(阈值循环,Threshold Cycle)是扩增曲线和阈值线的交叉点(图1B)。它是PCR反应中模板浓度的相对测量。除了模板浓度外,还有许多因素会影响CT的绝对值。我们将要讨论最常见的影响CT值的非模板依赖性因素,并描述如何评估实时定量PCR反应的效果。

Figure 1. A: Rn is the fluorescence of the reporter dye divided by the fluorescence of a passive reference dye. In other words, Rn is the reporter signal normalized to the fluorescence signal of ROX™. In this view, Rn is graphed versus cycle. B: ΔRn is Rn minus the baseline, graphed here versus the cycle of PCR. C: Amplification plot shows the Log (ΔRn) graphed versus cycle.
图1显示了实时PCR反应扩增图的几个参数。图1B的对数期对应图1C的线性期。在图1C扩增图中,阈值必须设在线性期中。当模板量减少时,CT值随之增加。然而,反应混合物或仪器中的任何改变,只要能影响与CT值计算相关的荧光测定,都会使CT值产生非模板依赖性的变化。因此,在不同条件下或用不同试剂进行的PCR反应产生的CT值不可以直接进行比较。
反应液成分的影响
  任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。图2显示了某个Taqman探针在两种不同的反应液背景下的原始荧光数据。尽管两组反应的扩增目标、探针和ROX(参比荧光)浓度都相同,反应液A中的荧光信号强度更强。
Figure 2. Raw fluorescence data obtained with one assay and two master mixes with the same ROX™ level. The difference in signal is due to the master position. Reaction was performed on an Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System with a VIC® MGB probe. The X axis shows the emission wavelength of the fluorophore and the Y axis shows the intensity of the emission.
  因此,如图3所示,产生的△Rn值也