CYP450 3A及其等位基因在体外药物代谢和药物相互作用中的对比研究.pdf

西北大学硕士学位论文CYP450 3A及其等位基因在体外药物代谢和药物相互作用中的对比研究姓名:李拴美申请学位级别:硕士专业:生物化学与分子生物学指导教师:陈超20090401CYP4503A及其等位基因在体外药物代谢和药物相互作用中的对比研究中文摘要目的:人细胞色素P450(CYP450)在肝脏中是含有亚铁血红素蛋白的超基因家族。参与大部分药物的代谢过程,也被称为混合功能氧化酶或单加氧酶。CYP3A被认为是人类P450家族在某些器官中最主要的功能形式。约占肝脏中总P450含量的30%,参与45%.60%常用药物在体内的代谢转化过程,包括氧化、过氧化或者还原等。CYP3A4和CYP3A5是肝脏和肠道中主要的CYP3A功能形式,代谢大部分相同的底物,但具有不同的代谢常数。而且由于这两者在个体中含量的不同,因此可能具有不同的药物代谢能力。CYP3A4亚家族中由于基因、年龄、疾病状态等因素,酶活性之间具有明显的个体差异,不仅表现在肝脏表达水平差异约40倍,且个体对药物的体内代谢能力也相差10倍左右。其中,基因因素的作用约占60%'--90%。目前,发现许多CYP3A4等位基因可能是造成个体间药物代谢差异的一个重要因素。实验目的是:通过体外的对比研究,找出CYP4503A的CYP3A5球1A(WT)(野生型)和CYP3A4幸1A(WT)和CYP3A4木3(M445T),宰4(1118V),丰17(F189S),宰18(L293P)等位基因在药物代谢和药物抑SUre的差异,分析其差异性存在的原因。方法:在已有的CYP3A4和CYP3A5的野生型模板情况下,利用不对称PCR的方法在CYP3A4野生型基因中引入各等位基因的突变位点,利用酶KpnI和XhoI消化产生插入片段,与含有同样酶切位点的大肠杆菌pYES2/CT载体进行连接,然后转化到大肠杆菌中。通过氨苄青霉素抗性标记筛选出重组子,初步鉴定后,再通过测序确认,无非同义突变后,转化入整合有POR基因的酵母菌株中,利用半乳糖诱导重组子在酵母系统中进行表达,差速离心法制备得到微粒体。并用CYP3A的特异性反应:荧光底物DBF(Dibenzylfluorescein)的去***化和硝苯地平的氧化,进行酶动力学的分析,非线性回归分析法计算出‰值和‰值,进而得到体外代谢的内在清除率CLint,以此为依据比较各重组酶的代谢差异。与此同时,使用原生型和各突变株微粒体蛋白在两种检测系统中分别对19种和6种药物进行筛选,求出其IC50值,研究药物抑制的相互作用。结果:酿酒酵母表达体系是CYP450酶系理想的体外表达体系。体外酶动力学和药物抑制的对比研究中发现:除CYP3A4*17等位基因酶外,3A5-WT,,和CYP3A4水3,书4,"18均能将DBF和硝苯地平代谢成相应的产物,"17号由于活性几乎丧失因此也无法进行后续的药物抑制实验。在CYP3A4和CYP3A5的对比研究中发现:()。⑦<,n≥3)。在两种底物的抑制实验中,两株野生型均能被***康唑强烈的抑制,,,,uM。另外18种药物除了那些对两者都不存在抑制的药物外,、W的4倍。:各等位基因对DBF的亲和力与WT相当‰相近),母3和"(p<),(p=)。各等位基因对硝苯地平的亲和力均比wT低(‰、),书4和"(p<),拳3与WT相当(p=)。以DBF为底物时,药物对wT和各等位基因的抑制程度排序为:***康唑>地尔硫卓>曲格列***>舍曲林>维拉帕米>***西汀>大扶康>奥美拉唑>红霉素>来适可>文迪亚>泰洛平>普拉固=立普陀=华法林=万络=辛伐他汀=西咪替汀。药物对wT和各等位基因酶的抑制程度的排序为:牛3>"18>WT>*4。以硝苯地平为底物时,药物对WT和各等位基因的抑制程度排序为:***康唑>地尔硫卓>维拉帕米>大扶康>西乐葆>万络,六种药对、胛和各等位基因酶的抑制程度的排序为:WT>木18>术3>母4。针对某种药物的具体抑制情况,3A4多态性现象依然存在,且存在明显的底物依赖现象。氨基酸顺序不同或者改变后,酶动力学特征发生明显改变,且对药物抑制的程度也发生了一定变化。结