第十一章 微生物和基因工程.doc

第十一章微生物和基因工程
概述
自从分子生物学家发现所有生物的遗传信息都是由DNA分子携带并发现了基因的密码后,人们就一直致力于将分子生物学的这一划时代成果用于微生物细胞的改造,使得微生物细胞能够结累更多的目标产物、合成新的代谢产物及转化原本不能转化的底物或有毒物质。通过科学家们的不懈努力,基因工程已经成了工业微生物菌种选育的重要手段,正在发酵工业中发挥愈来愈大的作用。可以说工业微生物遗传育种取得的重要进展是基因工程发展的基础之一,现在又为工业微生物的育种提供了新的、有力的工具。两者始终存在着十分密切的依赖关系。
基因克隆是重组DNA技术的关键步骤。这里,基因定义为细胞的染色体中含有遗传信息的基本单元。在对基因进行操纵之前,必须对DNA分子的脱氧核糖核酸顺序、各个结构单元的功能及其相互关系有一个清楚的认识,即所谓的基因组。目前,许多微生物、植物、动物及人类基因组计划已经完成或即将完成,怎样利用从基因组中获得的大量信息为人类服务已经成了生物技术的重要研究内容和发展方向。但是这些基因组、特别是人类基因组太复杂,很难讲清楚其功能和组织。因此本章将只讨论最简单的基因组为例对DNA分子的核苷序列分析和结构基因的获得进行简要讨论。
早在1978年猴子病毒SV40的DNA分子的核苷序列就已经完全清楚,它有5,243个碱基对,这些碱基对构成了五个结构基因。限制性内切酶(Restriction endonuclease)对基因序列分析作出了巨大的贡献,限制性内切酶是一类从细菌中分离得到的能够将DNA分子在特定的位点进行切断的酶。限制性内切酶的功能是将一个很大的DNA分子切割成许多良好定义的碎片,以便进一步研究。目前已经从约250种细菌中提纯出了500余种限制性内切酶。其中典型的如从大肠杆菌得到的EcoRI,专门作用于GAATTC核苷序列;又如从白色短小杆菌(Brevibacterium albidum)A核苷序列。
:
T G G C C A G A A T T C
A C C G G T C T T A A G
T G G C C A G A A T T C
A C C G G T C T T A A G
(b)
限制性内切酶的两种切断方式:(a)平端,(b)粘性末端
沿对称线切断形成两个平端分子()。
在对称线附近沿对称位置切断形成两个含粘性末端(Sticky ends)的分子()。这种方式都在重组DNA技术中使用。
,。
由于限制性内切酶所能识别的核苷序列是唯一的,因此在一个DNA分子中的切割位点有限。被切割下来的DNA碎片的分离时需要应用一项非常有用的技术:凝胶电泳。然后就能进一步研究每个DNA碎片的结构和功能。利用不同的限制性内切酶反复进行上述过程,就能够最终确定DNA分子的核苷序列和鉴别它所包含的结构基因。现在已经有了全自动DNA测序仪,利用这类仪器可以大大提高核苷序列分析的速度。此外现在已经建立了各种基因库,将分析得到基因核苷序列与基因库中已知结构基因的核苷序列进行比较就能够确定该基因是那一种结构基因或者是新发现的基因。

酶
识别序列
同裂酶
同尾酶
切割位点数目
l
SV40
pBR322
Aval
C¯PyCGPuG
SalI,XhoI,XmaI
8
0
1
BamHI
G¯
BstI
BclI,BglII,MboI,
Sau3A,XhoII
5
1
1
BclI
T¯GATCA
BamHI,BglII,MboI,
Sau3A,XhoII
7
1
0
BglII
A¯GATCT
BamHI,BclII,MboI,
Sau3A,XhoII
6
0
0
ClaI
AT¯CGAT
AccI,AcyI,AsYII,
HpaII,TaqI
15
0
1
EcoRI
G¯AATTC
5
1
1
EcoRII
¯CC(A/C)GG
AtuI,ApyI
>35
16
6
HaeIII
BspRI,BsuRI
>50
19
22
HgaI
GACGC(N)5¯
CTGCG(N)10¯
>50
0
11
HhaI
GCG¯C
FnuDIII,HinPI
>50
2
31
HincII
CTPy¯PuAC
HindII
34
7
2
HindII
GTPy¯PuAC
HincII,HinJ