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生化分离技术 DNA,RNA 和蛋白质的提取学生: 徐泽彬专业:生物化工学号: 201306032 提要生物大分子提取 1核酸传统提取法 2核酸固相提取法 3蛋白质的提取 4 生物大分子?与化学产品相比, 生物大分子的制备有以下主要特点: ⑴生物材料的组成极其复杂,有数百种至几千种化合物。⑵生物大分子的含量极微,分离纯化的步骤繁多,流程长。⑶生物大分子离开了生物体内的环境极易失活, 因此如何防止其失活,就是生物大分子提取制备最困难之处。⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的, 温度、 pH 值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响,很难准确估计和判断。核酸提取的历史核酸是 1869 年米歇尔() 在脓液白细胞中发现的,他当时称之为核素。阿尔特曼() 于 1889 年认识其酸性后,定名为核酸。核酸分为核糖核酸(RNA) 和脱氧核糖核酸(DNA) 两大类。核酸提取的历史质粒(Plasmid) 是一种染色体外的稳定遗传因子, 大小从 1-200 kb 不等,为双链、闭环的 DNA 分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。核酸提取的历史 1869 年,瑞士医师弗雷德里希·米歇尔首例成功的进行了核酸提取。起初,他关注于组成白细胞各种蛋白质,并指出蛋白质是细胞质的主要成分。但在随后的测试试验中发现,当加入酸性溶液时溶液中生成一种沉淀物,再加入碱性溶液时沉淀继而溶解消失。米歇尔首例提取出粗糙的 DNA ,米歇尔成功从细胞中提取出 DNA 后,一些研究者纷纷效仿,并在材料、试剂的应用上进行了不断的探索,由此发展了许多核酸的生物分子提取技术。 EB-CsCl 密度梯度离心法 TRIzol 法 CTAB 法 SDS 法 oligo(dT)- 纤维素柱层析法核酸传统提取方法核酸传统提取方法—— TRIzol 法异硫***酸胍/苯酚法( TRIzol 法) 原理: 核酸在中性条件下,因磷酸基解离而带负电荷,这一部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下,磷酸基的负电荷消失,水溶性下降。因此,在酸性酚的处理下, DNA 向疏水性的酚层移动,而 RNA 由于有-OH 的存在有亲水性,因此向水层移动。核酸传统提取方法—— TRIzol 法 TRIzol 试剂中的主要成分为异硫***酸胍和苯酚,其中异硫***酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使 RNA 与蛋白质分离,并将 RNA 释放到溶液中。当加入***仿时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使 RNA 进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样 RNA 与仍留在有机相中的蛋白质和 DNA 便分离开。水相层主要为 RNA ,有机层主要为 DNA 和蛋白质。