分枝杆菌细胞壁相关毒力基因的分离鉴定和功能的分析研究及噬菌体报告系统在快速检测结核分枝杆菌药物敏感性中的应用.pdf

论文独创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了。谢意。作者签名趟!!竺日期:士监:￡:2 论文使用授权声明本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的沦文在解密后遵守此规定。佧挂名:拉新签名::显:笸』硕士学位论文中文摘要硕士研究生朱江化导师高谦分枝杆菌细胞壁相关毒力基因的分离鉴定和功能研究及噬菌体报告系统在快速检测结核分枝杆菌药物敏感性中的应用摘要结核病是一种对人类健康及社会稳定构成严重威胁的传染性疾病。在上个世纪中期,随着各种抗结核药物的发现,人类对于结核病的控制取得了辉煌的成就。但是随着耐药结核菌的出现及流行,HIV和结核菌的共感染,结核病这种“白色瘟疫”又有重新抬头的趋势。结核分枝杆菌独特的细胞壁上诸多的毒力相关因子在其致病中起到了重要的作用。筛选出这些毒力相关因子,阐明其代谢途径及功能可以帮助我们进一步理解结核菌的致病机制,为寻求新的治疗结核的手段提供理论基础。另一方面,传统的结核分枝杆菌药物敏感性实验耗时久,难以对临床结核病的治疗发挥及时的指导作用,因此开发一种廉价但快速的结核分枝杆菌药物敏感性检测方法对指导耐药结核病的治疗以及控制其传播具有重要意义。全文分两部分: 第一部分海分枝杆菌细胞壁毒力相关基因的分离鉴定及其功能研究因生长相对快速、对人体危害小,海分枝杆菌正越来越多的被作为一种研究致病性分枝杆菌的模型。arT7噬菌体转座系统,我们建立了海分枝杆菌的随机突变库。以细菌在固体培养基上的菌落形态改变以及显微镜下的索状结构改变为标志,筛选出两个索状结构突变株——02c4和02C10突变株,其插入失活的基因与结核分枝杆菌基因ppsA和mas基因高度同源。ppsA和mas均为结核分枝杆菌细胞壁毒力因子PDlM合成通路上的重要基因。经细胞壁脂质成分的薄层色谱分析证实该两株海分枝杆菌突变株细胞壁的PDIM均缺失。我们重点研究了02C10 Amas突变株。02C10 dmas在体外环境中的生长速度与野生株并无差异,扫描电镜下微观结构改变不显著,但是在巨噬细胞内的复制、繁殖受到抑制,注射入斑马鱼腹腔后对斑马鱼的致死力急剧下降,并且不形成肉芽肿病理改变。因此,PDIM对于海分枝杆菌在巨噬细胞以及宿主体内的存活非常重要, 这一结论与结核菌中研究结果相一致。 arT7噬菌体建立了海分枝杆菌随机突变库,以海分枝杆菌为模型筛选出两个分枝杆菌细胞壁毒力相关基因,并建立了海分枝杆菌的毒力检测系统,发现PDIM在海分枝杆菌的致病性中起到重要重要的作用。第二部分应用噬菌体报告系统检测结核分枝杆菌药物敏感性本研究旨在建立快速检测结核分枝杆菌药物敏感性的噬菌体报告系统(LRPs),评估其在检测异烟肼(INH),利福平(RFP),链霉素(sM)和乙***丁醇(EMB) 敏感性中的应用价值。应用LRPs检测49株WHO质控菌株及57抹临床菌株共计106株转种的新鲜结核分枝杆菌对四种药物的敏感性,并与比例法相比较。%, ,%%;以比例法为标准,%,%,%和 %,%,%,%%。经配对x 2检验分析, 对于转种过的新鲜菌株,LRPs与比例法对四种药物耐药的检测结果无统计学差异。随后,我们应用LRPs直接检测了157株上海市疾病预防控制中心收集的痰培养菌株的药物敏感性。结果只有39株的LRPs检测结果有效,其对INH,RFP, %,%,%和 %。重新转种两种方法检测结果不一致的菌株,再次用LRPs法检测后,LRPs %,*/0,%和 %。噬菌体报告系统检测固体培养基上新鲜的结核分枝杆菌药物敏感性准确快速、可重复性强。但是对于上海市疾病预防控制中心模式下的痰培养标本的直接检测有效率不高,错误较多,可能与该模式下结核菌活力减弱相关。如果需将 LRPs应用于临床检测,需要较严格的控制结核菌的质量,或与结核菌快速培养装置联用以达到快速准确检测的目的。关键词:分枝杆菌,结核病:海分枝杆菌;分枝杆菌噬菌体;转座子;药物敏感性检测 2 Abstract OIMaster Disse