QPCR技术细节 ppt课件.ppt

细节决定成败
QPCR的技术细节对实验结果的影响
QPCR技术细节 ppt课件
2021/3/26
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内容概要
荧光定量PCR的原理
荧光定量PCR的标记方法
实验流程及注意事项
荧光定量PCR解析方法
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实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析
与常规 PCR技术比较：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
荧光定量PCR原理
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扩增曲线
荧光阈值
Ct值
荧光定量PCR原理
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在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。
反应初期，目的DN***段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DN***段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。
多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。
PCR产物的积累规律
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PCR产物的积累规律示意图
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荧光定量PCR定量原理
扩增曲线
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荧光定量PCR定量原理
为什么终点定量不准确呢？
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荧光定量PCR定量原理
尽管终点产物的量不恒定，但人们发现Ct（cycle threshold）与模板起始浓度有密切联系。
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Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数
Cycle（循环数）
Rn（荧光强度）
Ct value
荧光定量PCR原理－－Ct值
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