高效液相色谱法相关参数测定.ppt

高效液相色谱法相关参数测定
二、高效液相色谱法的特点
特点：高压、高效、高速
高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
三、流程及主要部件

离子色谱(Ion chromatography)
离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。
五、 离子对色谱(Ion pair chromatography)
原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；
阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；
阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；
反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙***-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。
六、 排阻色谱色谱(Size- exclusion chromatography)
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；
原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。
全部在死体积前出峰；
可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离
七、 亲和色谱(AC)( Affinity chromatograph)
原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。
先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联***等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。
液相色谱的固定相与流动相
一、液相色谱固定相 Stationary phases of LC
1. 液-液分配及离子对分离固定相
（1）全多孔型担体
由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；
现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体
（薄壳型微珠担体）
30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相；
a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C
b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；
c. 硅碳键型： ≡Si—C
d. 硅氮键型： ≡Si—N
化学键合固定相的特点
（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；
（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；
耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；
（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；
（5）有利于梯度洗脱；
存在着双重分离机制：
(键合基团的覆盖率决定分离机理)
高覆盖率：分配为主；
低覆盖率：吸附为主；
-固吸附分离固定相
种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰***等；
结构类型：全多孔型和薄壳型；
粒度：5～10 μm；

结构类别：
（1）薄壳型离子交换树脂
薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；
（2）离子交换键合固定相
薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）
树脂类别：
（1） 阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）
（2） 阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）
4. 空间排阻分离固定相
（1）软质凝胶
葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；
水为流动相。适用于常压排阻分离。
（2）半硬质凝胶
苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；
非极性有机溶剂为流动相，不能用***、乙醇等极性溶剂
（3）硬质凝胶
多孔硅胶、多孔玻