酿酒酵母INO1基因地克隆.doc

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酿酒酵母INO1基因的克隆
黄贞杰1,2,3，叶冰莹1,2,3 ，陈由强1,2,3★
〔，某某某某350108；，某某某物由某某生工生物工程某某合成。质粒小提取试剂盒〔天根生化科技某某〕； SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)；其他分子生物学试剂均购于TAKARA公司与Sigma公司。其他生化试剂的配制参照分子克隆实验指南。
主要仪器和设备
全自动凝胶成像分析仪〔某某培清科技〕；2720 Thermal Cycler PCR仪(Applied Biosystems)；DYY26B型稳压稳流电泳仪〔市六一仪器厂〕；GeneQuant pro分光光度计(Amersham Biosciences)；TGL-16M高速台式冷冻离心机〔某某湘仪离心机仪器某某〕；净化工作台〔某某净化设备某某〕。
原始酿酒酵母菌株s288c活化后，使用YPD固体培养基进展平皿划线别离得到酿酒酵母菌株s288c单菌落，牙签挑取单菌落接至50 ml YPD液体培养基进展30 ℃摇瓶培养24-30 h，离心去上清；按照Takara公司酿酒酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
INO1基因序列扩增
根据NCBI上的酿酒酵母S288C的肌醇-3-磷酸合成酶编码基因INO1用引物设计软件设计引物，引物序列如下：
上游引物5’- TAGTTACCGACAAGTGCACGTACA -3'，
下游引物5'-AGTTCGTTTTGAGAAGGCAATCCA -3'
以酿酒酵母S288C基因组DNA为模板进展PCR扩增。反响条件如下：预变性94℃ 5 min，变性94℃30s，退火54℃ 30s,延伸72℃ 97s，30个循环，延长72℃10min保存4℃。反响完毕后取2 uLPCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳进展检测。采用Promega公司的胶回收试剂盒SV Gel and PCR Clean-Up System进展胶回收。
INO1基因克隆
PCR回收产物的连接与转化
取回收后的PCR产物与PMD-19T载体进展连接(表1)。连接产物采用CaCl2法转化DH5α
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感受态细胞。在含有IPTG与X–gal 的LB/Amp平板上进展蓝白斑筛选。
表1　PMD-19T载体与PCR产物连接体系
Table 1　ThePMD-19T vectorand PCR productionligation system
反响物
体积(μL)
SolutionⅠ(含DNAligase)
5
PMD-19T载体
1
PCR回收产物
ddH2O
加至10
稍离心混匀，16℃连接过夜
阳性克隆的鉴定与质粒提取
挑取白色菌落摇菌，进展菌液PCR检测。
表2　菌液PCR验证
Table 2　Thebacteria liquidPCR for verification
反响物
体积(μL)
10× ExTaq Buffer
1
dNTP ( mmol · L-1)