宏基因组测序技术检测方法.docx

宏基因组测序技术检测标准简介: 宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析,对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展,为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物,也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。目前又可以分为针对 16s DNA/18sDNA/IT S 测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。一、 16s DNA/18s DNA/ITS 测序 16sDNA 是最常用的微生物物种分子鉴定的标签,, 通过对样品中 16sDN A 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。目前,普遍使用 Roche 45 4 平台来对环境样品进行 16s DNA 测序。因为 16s DNA 序列比较相似,读长短的话,难以进行有效的比对,而 454 平台的平均读长在 400bp 左右,可以很好的避免此类问题。二、宏基因组全测序在这种测序方式中, 我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体, 然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。可以发现新的基因,可以进行基因的预测,甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。此外,该项测序不单可以针对 DNA 水平,也可以针对全 RNA 进行基因表达水平的研究。样品处理: 宏基因组样品收集主要有口腔,下呼吸道痰液,下呼吸道灌洗液,皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范(人)所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。核酸提取: 宏基因组核酸提取主要有两种方法:膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液,灌洗液两种方法都适用,对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。核酸提取后用 NanoDrop ND-1000 测定, 260/280 = - , 260/230 = - ,电泳检测 DNA 应是完整的一条带。测序 Sequencing 1) 16S/18S 测序: Sanger 测序: 用于低通量的 16S/18S DNA 测序, 提取宏基因组后, 首先通过 PCR 将 16S/18 S 序列扩增出来,再将其连接到克隆载体上,导入感受态细胞,涂平板做蓝白斑筛选, 选出阳性克隆提质粒, 对质粒进行测序反应, 测序反应后纯化后用 ABI 313 0 或 ABI 3730 进行毛细管电泳测序。由于其测序准确率比较高,而通量非常低,现通常用做二代测序结果的验证。 454 Platform : 454 平台主要包括两种测序系统: 454 GS FLX+ System 和 454 GS Junior System 。 454 GS FLX+ System 测序读长可以达到 600-1000bp , 通量 450-700M , GS Junior Syste m 测序读长在 400bp 左右,通量在 35M 。文库构建: 用 fusion Primer 扩增核糖体 RNA , 将已扩增的 rRNA 直接做乳液 PCR ,在 GS FLX+ 和 G