生分子生物学实验讲义技术总结.doc

实验一人外周血淋巴细胞总 RNA 的提取、电泳一、实验目的学****并掌握人外周血淋巴细胞总 RN A的分离提取及琼脂糖凝胶电泳检测方法。二、实验原理细胞的总 RNA 主要由 rRNA 、 tRNA 及 mRNA 组成,其中 rRNA 含量最多(占 80%~85 %)。在pH 微酸环境下, RNA 相对稳定,碱性环境下,易分解。 RNA 酶极为稳定且广泛存在于细胞内外,环境中存在大量 RNA 酶,极易降解 RNA ,因而在 RNA 提取及相关分析实验中,如何避免 RNA 酶的污染及抑制内源和外源性 RNA 活性,是实验成败的关键。在 RNA 相关实验过程中,须树立 RNase-free 思想: 1 )样品新鲜,保存得当,以强变性剂,防止内源性 RNase ;2 )人体上遍布 RNase, 养成操作时勤换一次性手套和口罩的好****惯; 3 )空气中灰尘和细菌含 RNase ,应建立干净的操作环境; 实验介绍如何使用 Takar a公司的 RNAiso Plus试剂来分离人外周血淋巴细胞的总 RNA 。 RNAiso Plus 是一种酸性苯酚提取试剂,含有去垢剂,和使 RNas e 失活的异硫***酸胍,它能在破碎和溶解细胞时保持 RNA 的完整性,防止 RN A 降解。(注意: RNAiso Plus具有强烈腐蚀作用,小心操作。) 三、实验材料、试剂与器材 1、人外周血淋巴细胞( 5х10 6) 2、 DEPC 水溶液, PBS , TAE 3、***仿,异丙醇,乙醇均为分析纯 4、 RNAiso Plus试剂购自 Takara 公司 5、无 RNase 的枪头(1000 、200 、20ul),离心管( 、 PCR 管, 、 2ml 、 7ml 离心管)。 6、 PE 手套、离心机四、实验步骤 提取前的准备 1)、塑料制品的处理: -% 的 DEPC (焦碳酸二乙酯水)浸泡过夜: ?必须保证塑料制品被水浸透,内部没有气泡,对于小枪头、 、 PC R 管,必要时应用枪逐个的用水灌注(这一步对于以后的实验保证非常重要, 须小心操作)。?泡过夜后,用镊子逐个敲去管内的 DEPC 水,装于干烤过的烧杯,加锡箔纸密封杯口;尽量敲去枪头内的水,装于处理过的枪头盒,报纸包好。?121 ℃,30分钟高压灭菌,以消除残存的 DEPC, 否则 DEPC 也能和腺嘌呤作用而破坏 mRNA 活性,且抑制后继酶促反应,烘干,备用。? DEPC 是蛋白质强变性剂, 它和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。具强挥发性,致癌物, 因而使用时应在通风橱操作,需戴一次性手套,一次性口罩,小心操作。 2)、试剂的配制: 试验所用试剂也可用 DEPC 处理过夜,再高压灭菌,但 DEPC 能与***和巯基反应,因而含 Tris 和 DTT 的试剂不能用 DEPC 处理,可用 DEPC 处理的水配制,并尽可能用未曾开封的试剂,然后高压灭菌。所需烧杯等必须干烤处理以后方可用。 - ‰的 DEPC 水(三蒸水), 磁力搅拌器搅拌过夜或者摇床低速振荡过夜, 121 ℃,30分钟高压灭菌。 的提取: 用淋巴细胞分离液分离人外周血淋巴细胞( PBMC ) ,体外培养取5х10 6个体外培养的 PBMC 悬液置于 EP 管中,离心收集细胞沉淀向 EP 管中加入 1 ml RNAiso Pl us 裂解细胞, 用移液枪反复吹吸,直至裂解液中无明显沉淀室温( 15-30 ℃)静置 5 分钟,然后从核蛋白中分离 RNA 加入***仿( RNAiso Plus 的 1/5 体积量) ,盖紧离心管盖,混合至溶液乳化呈乳白色, 室温静置 5 分钟 12,000 g4℃离心 15 分钟。从离心机中小心取出离心管,此时溶液分为三层, 即: 无色的上清液(含 RNA )、中间的白色蛋白层( 大部分为 DNA ) 及带有颜色的下层有机相。小心吸取上层无色水样层转移至一新 EP 管中向上清中加入 -1 倍 RNAiso Plus 体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后, 室温下静置 10 分钟。 12000g ,4 oC 离心 10min ,轻轻倒去上清加入与 RNAiso Plus 等量的乙醇洗涤 RNA 沉淀一次, 7500r/min ,4 oC 离心 5min 弃上清,倒置 EP 管, 5-10min 空气干燥(勿完全干躁,难再溶) ,加入 20ul 的 DEPC 水溶解沉淀注意: 异硫***酸胍是很强的蛋白变性剂, 但它不能使 RNA 酶发生不可逆失活。因此, 假如去蛋白后,样本被残余的 RNA 酶污染,这些酶会在变性剂去除后,重新恢复活性。因此, 将水相中 RNA 彻底从有机相中分离出