生实验-RuBPCase活性测定技术技术总结.ppt

RuBPCase 活性测定技术 1,5- 二磷酸核***糖羧化酶( . ) 14C放射性同位素示踪法目录 1. Ru bis co 的发现和催化反应 2. Ru bis co 的亚基组成 3. Ru bis co 的体内外活化 4. Ru bis co 的活性测定方法 1. Ru bis co 的发现和催化反应? 1950s Wildman SG Fraction I protein ? 1954 Calvin RuBPCase purified ? 1968 Kawashima Fraction I protein crystallization Fraction I protein = RuBPCase ? 1970s RuBPOase found ?《 Nature 》、《 Science 》上文章认为它是光合作用的限速酶,甚至是产量的限速酶! RuBPCase 催化反应以上两个反应为竞争性反应 PGA CO RuBP RuBPCase 2 2??????P glyconate PGA O RuBP RuBPOase ???????? 2???????? 2 2 2 2 CO v Ov O CO v v o c o c????Ω:特征因子受酶一级序列和构象影响(8ruc active site) Ω特征因子?特征因子越大,利用低 CO 2的能力越强;对于 C 3植物有重要意义; ?生物越低等,特征因子越小; ?一般高等植物的特征因子 50 - 100 ,目前自然界发现最高的为海洋红藻的 Rubisco ,特征因子为 210 左右; ? Vmax 同Ω很难兼得。低效率的酶? Turnover number 转换数 CAT: 10000 RuBPCase: 3 -4 ? Site-directed mutation Spreizter 等试图分子改造 2. Ru bis co 的亚基组成? Form I: L 8S 8高等植物? Form II: (L 2) n光合细菌? Form III: 古核生物? LSU 叶绿体编码; SSU 细胞核编码; ?自然界最丰富的蛋白质? Rubisco 在叶绿体中含量达到 300mg/ml 3. Ru bis co 的体内外活化? active form ? inactive form ? in vitro activation 用于活化的 CO 2不同于参与反应的 CO 2 Mg 2+: 20mM A CO 2 : 10mM (NaHCO 3) )( )( 22 2 ,2 active ECM Mg CO E CO E CO inactive E fast pH slow A??????????????植物体内无法实现! ?初始活性 initial activity ?总活性 total activity ?活化率