【大学课件】常见的生化与分子生物学技术大串讲.ppt

常见的生化与分子生物学技术常见的生化与分子生物学技术生物大分子的提取和纯化电泳技术 PCR 技术核酸序列的测定蛋白质相互作用 Agrose PAGE 双向电泳杂交技术酶联免疫技术层析技术、超滤技术、膜技术检测和纯化分离生命现象生化组分分析 1、结构与性质 2、功能 3、代谢及其细胞调控改造利用生物化学研究技术方法?经典的研究步骤: ?分离生化组分(细胞器和生物分子); ?分析生化组分的结构; ?分析生化组分的功能和代谢(合成与分解)及其相互作用。 2017-1-22 3生物化学研究技术方法?生物化学研究技术: ?分离技术:沉淀、吸附、膜分离(过滤、透析等)、离心、层析、电泳等; ?分析检测技术:电泳、层析、光谱、质谱、电化学技术、分子标记等。?分子生物学研究技术:基因重组、分子杂交、 PCR 与反转录、核酸测序、免疫技术、生物芯片等等。 2017-1-22 4 生物大分子分离纯化的一般步骤和原则层析法电泳法超离心法透析和超滤?盐析( 硫酸铵盐析) ?等点电沉淀?有机溶剂沉淀?离心│←前处理→│←粗分级→│←细分级→│?材料选择与处理?细胞破碎(机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理) 生物组织→→提取液→→粗产品→→结晶?分子大小?溶解度?电荷性质?吸附性质?生物亲和力依据原理要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有: ?在水和各种有机溶剂中的溶解性。?在不同温度、 pH 值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。?固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。?各种物理性质:如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。?其他化学性质:如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。?对其他生物分子的特殊亲和力。分离纯化的一般程序 1、材料的选择和预处理 2、破碎细胞及提取(有时还需要进行细胞器的分离) 3、分离纯化:包括粗分级分离和细分级分离 其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。生物大分子的浓缩?沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂,使有效的成分变为沉淀,经过离心或过滤收集的沉淀物,加少量缓冲液溶解后,在经离心出去不溶物,获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。?盐析法: 有机溶剂沉淀法;等电点沉淀法;非离子多聚体沉淀法;生成盐复合物沉淀法;热变性沉淀法;酸碱变性沉淀法等。?吸附法:将干葡聚糖凝胶加入提取液中,由于凝胶吸水,提取液的体积可缩小三倍左右。 ?超过滤法:把提取液装入过滤装置, 在空气或氮气的压力下,使小分子物质通过半透膜,大分子物质留在膜内。?透析浓缩法?减压蒸馏浓缩法:将提取液装入减压蒸馏装置中,在减压真空状态下进行蒸馏。?冰冻干燥法纯度鉴定?生物大分子经过分离提纯,最后还要鉴定制品的纯度。?蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有: SDS- 聚丙烯酰***凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法等。?纯的蛋白质在一定条件下进行电泳,将以单一的速度移动,它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中,应以单一的沉降速度移动。?选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度,必须同时采用 2-3 种不同的方法才能确定。