1生物统计与实验设计3常用分子生物学技术.ppt

第十二章第十二章常用分子生物学技术常用分子生物学技术第一节第一节凝胶电泳技术凝胶电泳技术一、电泳的原理将某种分子放到特定的电场中,它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率,它与电场强度成正比,与该分子所携带的净电荷数成正比,而与分子的磨擦系数成反比(分子大小、极性、介质的粘度系数等)。在生理条件下,核酸分子中的磷酸基团是离子化的,所以, DNA 和 RNA 实际上呈多聚阴离子状态( Polyanions )。将 DNA 、 RNA 放到电场中,它就会由负极→正极移动。常用固体支持介质琼脂糖( agarose )和聚丙烯酰***( polyarylamide )都属于固体支持介质,使用支持介质的目的是防止电泳过程中的对流和扩散,使得被分离的成分得到最大的分辨率。这些固体支持介质可以形成复杂的网孔结构, DNA 要穿过这些网孔才能到达正极,因此分子量小,结构致密的 DNA 分子就更容易穿过这些网孔,泳动的速度也越快。凝胶类型及浓度分离 DNA 片段的大小范围 % 琼脂糖 50000 ~1000 % 琼脂糖 20000 ~1000 % 琼脂糖 6000 ~300 4% 聚丙烯酰*** 1000 ~100 10% 聚丙烯酰*** 500 ~25 20% 聚丙烯酰*** 50 ~1 琼脂糖和聚丙烯酰***凝胶分辨 DNA 片段的能力二、琼脂糖凝胶电泳二、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物,它的分子结构大部分是由 1,3 联接的β-吡喃半乳糖, 1,4联接的 3,6脱水α-D 吡喃半乳糖交替而成的,其结构为: 在凝胶电泳中,一般加入溴化乙锭( EB ) --ethidium bromide 染色,此时,核酸分子在紫外光下发出荧光, 肉眼能看到约 50ng DNA 所形成的条带。染色: 三、聚丙烯酰***凝胶电泳三、聚丙烯酰***凝胶电泳聚丙烯酰***主要由丙烯酰***和 N,N′-甲叉双丙烯酰***聚合而成,这两种成分在有引发剂和增速剂存在的情况下,丙烯酰***的单体形成长链,由 N,N′-甲叉双丙烯酰***的双功能基团和链末端的自由功能基团反应而发生交联。丙烯酰***为白色结晶粉末,无味,分子量为 ,为中枢神经毒物。 N,N’-甲叉双丙烯酰***也为白色结晶粉末,无味,分子量为 ,亦为中枢神经毒物。 1% 的稀溶液与皮肤接触也会引起皮肤发炎,小鼠的确切致死量( LD50 ) 为170 mg/ ㎏, 所以在实验室操作时应尽量避免与之直接接触和吸入粉尘。聚丙烯酰***凝胶中常用的引发剂过硫酸铵和核黄素在碱性条件下可产生自由基,而增速剂 N,N,N′,N′-四***乙二铵( TEMED )可催化由过硫酸铵产生的自由基的形成,从而加速聚合。第二节第二节探针技术探针技术探针( probe ): 用来探知被测物存在的小分子 DNA 或 RNA 。标记物:探针上结合的易被检测的化合物。分子杂交( molecular hybridization ): 探针 DNA 或 RNA 与被测物的互补结合叫分子杂交。探针核酸探针: DNA 、 RNA 非核酸探针:酶、蛋白质等一、核酸探针一、核酸探针双链 DNA 探针 DNA 探针 DNA 探针核酸探针单链 DNA 探针 cDNA 探针 RNA 探针单链 RNA 探针放射性标记探针均匀标记探针探针标记非放射性标记探针非均匀的末端标记探针核酸探针的类型和称谓常有以下几种: 1. 1. 双链双链 DNA DNA 探针探针⑴切口平移法利用了 DNaseI 和 DNA 聚合酶 I的5 ’→3’聚合酶活性和 5 ’→3’外切酶活性。产生均匀标记的探针。⑵随机引物合成法原理:随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与 DNA 模板结合,在 Klenow 酶的作用下,合成与模板互补的 DNA 探针。优点是: (1) Klenow 片段没有 5‘→3’外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2) 反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒 DNA 模板也可进行反应。(3) 反应产物的比活性较高,可达 4×10 9 cpm/ μg探针。(4) 随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。