细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳.ppt

细胞凋亡的 DNA 琼脂糖凝胶电泳?细胞凋亡( apoptosis ) 细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程,凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。生物学意义: ①确保正常发育生长:清除多余的细胞②维持内环境稳定:清除受损、突变、衰老的细胞③积极防御功能:对病毒感染细胞阻止复制?细胞凋亡过程中有一系列特征性的形态学等的改变。其中最重要和最具有特征性的改变是 Ca 2+/ Mg 2+ 依赖性的核酸内切酶的激活而导致染色质 DNA 在核小体连接部位断裂,形成以 180~200 bp 为最小单位的单体或寡聚体片段。实验原理?本实验是利用琼脂糖凝胶电泳分析小鼠胸腺细胞 DNA 在地塞米松诱导下细胞的凋亡现象。凋亡细胞染色质 DNA 在核小体连接处断裂,形成 180-200 bp 或其整倍数的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯状电泳图谱(DNA ladder) ,而坏死细胞或凋亡后期的继发性坏死细胞 DNA 电泳后则成模糊的“涂片状”。材料 1. 凋亡细胞:经地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞 2. 提取 DNA :基因组 DNA 抽提试剂盒( RNA 酶、蛋白酶 K、悬浮液、裂解液、洗涤液、洗脱液、 DNA ladder 标准品等) 3. DNA 电泳: 1 % 的琼脂糖凝胶、点样缓冲液 4. 实验器材: 管、吸附柱、收集管、台式高速离心机、 65℃水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、紫外透射仪方法一、胸腺细胞的制备: 小鼠摘眼球并断椎处死,取胸腺,浸入含 5- 10% 小牛血清的 1640 培养液中,置铜网上研磨, 将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。 2000rpm , 离心 5min ,制成 1×10 7细胞悬液备用。二、提取胸腺细胞 DNA : ⑴裂解细胞阶段(使用到的试剂:裂解液=L 液、 RNaseA/ 蛋白酶 K液=A 液) ?将细胞离心后小心倒出液体,离心管中加入 100 μ lL液和 20μ lA液,充分混匀,置于 55℃温浴 20分钟,其间来回颠倒离心管 3-5 次。(2) 结合 DNA 阶段(使用到的试剂:结合缓冲液=B 液、 3MNaAC, ) ?加入 10μ l 3MNaAC ,随后加入 1250 μ l B 液,充分振荡混合均匀(重要!), 12000rpm 离心 3 min 。将上清分 2次加入到离心吸附管。静置 1 分钟, 12000rpm 离心 30s,倒掉收集管中废液。第二次同上,静置 1分钟,离心 30s。