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非放射性EMSA实验技术的专题讨论.docx


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1 网上找到的非放射性 EMSA 实验技术的专题讨论, 看了一部分, 感觉很有帮助, 收藏起来慢慢的学****来源: 耿冬峰的日志 EMSA 实验技术探讨 EMSA 是一个比较复杂的试验技术, 由于工作原因接触这个试验技术到现在也有三年多的时间了, 做了大概也有几百次吧, 那倒理想的试验结果的同时也碰到了很多莫名的问题和结果, 到现在为止还有没有解决的, 找不到原因的一个问题, 呵呵! 现和 smalldonkey 商量一下将我对这个实验技术的总结和一个心得写出来给大家分享, 批评指正. EMS A 实验技术作为一个经典的 DNA/protein,RNA/protei n 的检测技术, 不是很多简单的实验技术可以替代的! 比如曾经在我们这个论坛中有站友提到这样一个问题: 某公司的激活- 和转运检测试剂盒,监测是否激活 NF-KB 测试剂盒原理: NF- κB 未被激活时和 Iκ B-α形成一个复合物,分布在细胞浆中。在炎症因子、生长因子或趋化因子等可以激活 NF- κB 的刺激存在的情况下,Iκ B-α会在 Ser32 和 Ser36 被磷酸化, 随后被泛素- 蛋白酶体途径降解。 NF- κB和Iκ B-α解聚后,其核定位序列被暴露, 从而被转运到细胞核内促进 NF- κB 依赖的基因转录。通过免疫染色检测 NF- κB 的主要亚基 p65 是否被转移到细胞核内, 就可以判断 NF- κB NF- κB 激活-核转运检测试剂盒仅染色 p65 , 不染色 RelB 、 C-Rel 、 p50 和 p52 。使用本试剂盒染色后 NF- κB 呈红色荧光,细胞核呈蓝色荧光. 思考信号转导和检测的理论我做了这样的回答( 个人意见. 大家可以讨论!): 这种理论上来讲可行, 但是实际操作可能拿不到你想要得结果, 原因很简单, 凭染色来判断是很难区分程度上的差异的, 就比如做 WB 实验, 经典的还是化学发光的方法, 显色的方法只能得到信号比较强的蛋白, 遇到信号比较弱的蛋白就误差很大了, 第二点, 并不是所有能进核的蛋白都有结合 DNA 的能力, 如果结合了那才是真正的参与转录的转炉银子, 有的入核后却不能和 DNA 结合, 只能等着被降解! 其实总体而言大家做试验时都希望成功,但是 EMS A 试验技术的独特性和复杂性决定了, 要想做成功 EMSA 试验, 拿到阳性结果可总结为一句话: 把握整体, 注意细节! 我觉的 EMSA 的整体性包括 6 大点: 探针制备( 设计, 合成, 标记, 纯化, 退火); 个人实验设计(时间剃度浓度查阅文献等); 核蛋白制备; 浓度测定;EMSA 操作; 实验时竞争设计. 这六大点都是会直接影响到 EMSA 试验的成功与否! 中间就必须注意到这六大点的细节, 包括操作细节,在这点上, 我倒是很佩服美国佬的态度, 我记得 年那几个美国佬给我培训的试验技术的时候就严格的按照他们的规定每一个细节操作, 并养成一个实验****惯; 比如其中的一点: 他们培训我们在配置溶液的时候只要是液体的东西无论什么养成一个****惯就是摇一摇, 因为有些溶液静止时间长了有效的大颗粒可能下沉, 要是直接取会造成不均匀的误差, 到时候试验结果出了问题, 很难推断操作错误的地方, 养成一个****惯即使是蒸馏水也摇一摇, 呵呵, 倒不是说的这么夸张, 但强调的是一个严格而良好的试验****惯! 呵呵, 言归正传, 实验技术毕竟是一门动手性很强的科学, 理论还是和动手还是有一定差别的, 希望我的一些理论能给大家帮助. 下面我大概的介绍一下 EMSA 的一些理论和自己试验的心得, 以便站友学****另外,EMSA 是一个很大的试验. 我一时间也不能把所有的都罗列出来, 只能等大家遇到问题, 只要我有时间在线就尽力帮忙交流, 呵呵! 我做的最多的还是 NFKB, 此外还有 AP-1,STAT3, STAT5,HIF 等, 希望能于大家交流. 简介: EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是一种研究 DN A 与蛋白质或 RNA 与蛋白质相互作用的常用技术。这项技术是基于 DNA/ 蛋白质或 RNA/ 蛋白质复合体在聚丙烯酰***凝胶电泳( PAGE )中有不同迁移率的原理。当核转录因子与一条人工合成的特 2 异的 DNA 或 RNA 结合后,其在 PAGE 中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的 DNA ,从而检测到活化的与 DNA 或 RNA 结合的蛋白转录或调节因子。发展: 从发展史来看, 这项实验技术起初是用 32 P 同位素标记人工合成的寡核苷酸形成探针, 但是由于同位素的放射性很强, 而且半衰期为 14 天, 所以从定购到标记再到做完试验, 必须 14 天完成, 种

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