实验八聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳.doc

实验八聚丙烯酰***凝胶圆盘电泳【实验目的】 1. 掌握盘状聚丙烯酰***凝胶电泳的基本原理。 2. 学****盘状聚丙烯酰***凝胶电泳的操作技术,用于分离蛋白质。【实验原理】聚丙烯酰***凝胶电泳是以聚丙烯酰***作为支持物的一种电泳形式。单体- 丙烯酰***和交联剂- 甲叉双丙烯酰***相互作用可形成聚丙烯酰***, 该聚合反应以 TEMED 作为催化剂,以 APS 作为引发剂。丙烯酰***和甲叉双丙烯酰***的比例可决定凝胶网孔的大小,交联剂所占比重越大,凝胶的网孔就越小。利用聚丙烯酰***凝胶电泳进行蛋白质分离主要依据以下两个因素: 蛋白质所带静电荷: 在不同的 pH 条件下蛋白质所带电荷不同。在一定 C=O NH 2 C=O NH CH 2 C=O NH CH 2 =CH + AP TEMED NH CH 2 C=O NH CH 2— CH C=O NH 2— CH 2— CH C=O NH 2— CH 2— CH — C=O NH 2— CH 2— CH C=O NH 2—丙烯酰***甲叉双丙烯酰***聚丙烯酰*** CH 2 =CH CH 2 =CH — CH 2— CH — C=O CH 2— CH —的电场条件下蛋白质将向与其所带电荷相反的电极方向移动,移动速率取决于蛋白质表面电荷的数量,电压越强或电荷越多则蛋白质移动的越远。其次,蛋白质的形状和大小:蛋白质在电泳中所受的阻力主要取决于样品的大小与凝胶网孔大小之间的关系。蛋白质分子越小或凝胶网孔越大,所分离样品所受阻力就愈小, 则在电场中的迁移率就越大。在非变性电泳中, 天然蛋白质的分离就是蛋白质所带电荷、分子大小及分子形状等因素共同影响,作用的结果。电压 x 样品静电荷迁移率= 摩擦力浓缩效应可显著提高聚丙烯酰***凝胶电泳的分辨率,该效应可通过引入浓缩胶和不连续缓冲溶液系统而获得。浓缩胶处于分离胶的顶部,因此样品在进入分离胶之前首先要经过浓缩胶。它是由较低浓度的丙烯酰***构成,当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔较分离胶网孔大,样品的移动速度较快,最终使样品“堆积”在浓缩胶和分离胶之间。另外,浓缩胶还具有比分离胶更低的 pH 。浓缩胶内的缓冲溶液是 Tris-HCl ( pH ),该 pH 远低于 Tris 的 pK 值() 。分离胶内的缓冲溶液是 pH 的 Tris-HCl , 而电泳正负两极的缓冲溶液均为 pH Tris- 甘氨酸缓冲溶液。在浓缩胶中, 小分子并带有大量负电荷的 Cl - 在凝胶中的移动速率较快, 而电荷较少且分子量较大的甘氨酸的移动速率较慢。由于二者在同一电场中,具有相同的电流,由此形成的电压梯度导致甘氨酸离子始终跟随在 Cl - 的后面,带有负电荷的蛋白质样品则浓缩在甘氨酸离子和 Cl - 之间向正极移动。当样品进入 pH 的分离胶时, 甘氨酸的解离度增加, 在电场中的迁移率高于样品,蛋白质不再夹于两种离子之间向正极移动,这时的蛋白质依靠分子筛效应和电荷效应进行分离。【实验材料】 1. 实验器材 Bio-Rad 公司 Mini-Protean Ⅱ型电泳仪; 电源( 电压 200V , 电流 500mA ); 100 ℃沸水浴; Eppendorf 管;微量注射器( 50μl或 100 μl) ;带盖的玻璃或塑料小容器;摇床。 2. 实验试剂试剂号配方 pH 1 分离胶缓冲溶液 1mol/