基因工程4~5.doc

一、分子克隆常用的工具酶 1 、限制性核酸内切酶与 DNA 分子的体切割限制性核酸内切酶,是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割 DNA 双链结构的核酸内切酶。(1 )分类: ⅠⅡⅢⅠ:识别和切割位点不固定,随机性。Ⅲ:核酸内切酶活性和***化活性是不分开的。Ⅱ: 能在识别位点处切割 DNA , 切割位点固定。核酸内切酶活性和***化活性是分开的,常用。(2)Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性识别序列: 4~8 个核苷酸组成的特定核苷酸序列, 6 个最常见回文结构:两个顺序相同的拷贝在 DNA 链上呈反向排列。 EcoR Ⅰ5’-G| AATT C-3 ’3’-C TTAA | G-5 ’经限制酶切割后的位点,DNA 断裂类型: 粘性末端: (1)3 ’-OH 单链延伸的粘性末端. 如: Pst Ⅰ 5’-CTGCA |G- 3’5’-CTGCA G- 3’ 3’-G | ACGTC-5 ’3’-G ACGTC-5 ’(2)5 ’-P 单链延伸的粘性末端. 如: E coR Ⅰ平末端:如:Sma Ⅰ5’-CCC | GGG-3 ’3’-GGG | CCC-5 注:两种特殊的限制酶△同尾酶: 识别位点不同, 酶切后产生同样的粘性末段的两种酶, 连接后的切点均不能被上述两种酶切。如: BamH Ⅰ和 Bgl Ⅱ( GATC ); NheI 和 XbaI ( CTAG ) △同裂酶: 识别序列相同, 对***化切点敏感性不同的两种酶。如:Mbo Ⅰ和 Sau3A Ⅰ共同识别序列 GATC ,但对 G me ATC 切点,前者不能切,后者能切。(3) 影响限制性内切酶活性的因素 DNA 的纯度、温度、分子结构、限制酶的缓冲液及 DNA 的***化( 基因工程使用失去***化酶的大肠杆菌; 研究基因工程 DNA 的***化程度; 改变限制酶的识别特性) ?星号活性( 在非理想的条件下, 内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列, 这一现象称星号活性。) EcoR Ⅰ切 GAATTC EcoR Ⅰ*切 pupuATpypy 或 AATT 2、 DNA 连接酶和 DNA 分子的体外连接(1) DNA 连接酶( Ligase )是一种能够催化在双股 DNA 链的 3′-OH 和5′-P 之间形成磷酸二酯键的酶,可连接互补粘性末端或平端,不能连接单链 DNA 或裂口。(2 )粘性末端 DNA 片段的连接和单切点的去磷酸化平末端 DNA 片段的连接:(T 4 DNA 连接酶法;同聚物加尾法;用化学合成的衔接物连接 DNA 分子) 3 、其他工具酶(1 )大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ: △三种活性: 5’-3’聚合酶活性(在有 dNTP 时);3’外切酶活性(无 dNTP 时大亚基活性);5’外切核酸酶活性(无 dNTP 时小亚基活性) △在基因工程中的应用:缺口平移标记技术(2) DNA 聚合酶Ⅰ大片段( Klenow 酶): △活性: DNA 聚合酶活性( 切除小亚基, 保留大亚基);3’外切酶活性(无 dNT P 时) △在基因工程中的应用:标记粘性末端. ?-32P — dNTP 标记平末端?-32P — dNTP 将5’端伸出的末端填平可用来反转录合成双链 cDNA 补平粘性末端(3)T 4 DNA 聚合酶: 具有 5’-3’聚合酶活性和 3’-5’