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hits-clip步骤.doc

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文档介绍:
第一天: 1. 细胞培养在 100或 150m m 的平板上,用 PB S 漂洗,然后 place in Stratalinker with the cover off 。以 400 mJ/cm 2 照射一次和 additional 200 mJ/cm 2 in Stratalinker 。 2. 收集细胞悬液, 4℃下 2500rpm 离心细胞团 5min ,3 (~3x dry volume) 倍细胞沉淀体积的 PBS 重悬细胞团,每个 eppie 加入 1ml 的细胞悬液,在 4℃下快速离心,去上清,然后保存在-80 ℃备用(每管大约 200 μl 细胞)。备注: 1× HBSS : 50ml 10× Hank ’s 平衡盐溶液, Ca-Mg-free(Gibco, #14186-012) 5ml 1M HEPES, pH7.3 445ml ddH 2O 第二天: II .免疫沉淀 a. 溶液(现用现配) 1× PXL ( wash buffer ) 1× PBS ( 组织培养等级 tissue culture grade ; 不含 Mg 2+, Ca 2+) 0.1% SDS (来源:淘豆网[http://www.taodocs.com/p-70193989.html])0.5% 脱氧胆酸盐 0.5% NP-40 5× PXL ( 高盐 wash buffer ) 5× PBS ( 组织培养等级; 不含 Mg 2+, Ca 2+) 0.1% SDS 0.5% 脱氧胆酸盐 0.5% NP-40 1× PNK 缓冲液 50 mM Tris-Cl pH 7.4 10 mM MgCl 2 0.5% NP-40 1X PNK+EGTA Buffer 50 mM Tris-Cl pH 7.4 20 mM EGTA 0.5% NP-40 b. Bead 的制备: 每一 Eppie 的交联裂解液使用 400 μl 的蛋白 A 免疫磁珠(Dynal, 100.02) 用 pH 8.0 的 0.1 M 的磷酸钠溶液洗小珠三次。(这里使用高 pH 是因为能增加蛋白 A对抗体的结合。然而这需要所有免疫沉淀的缓冲液应该适用于你所用的抗体。例如, 我们发现有些抗体在缓冲液中不与脱氧胆酸盐作用。) 用 350 μl的 pH 8.0的 0.1 M 磷酸钠重悬小珠,加入 50μl桥联 Ab (来源:淘豆网[http://www.taodocs.com/p-70193989.html])( 2.4mg/m l; 兔抗鼠 IgG )。在室温旋转试管 45min ;用 pH 8.0 的 0.1 M 磷酸钠洗三次。在 400 μl pH 8.1的 0.1 M 磷酸钠溶液中重悬小珠,加入3μl的 2A 8或 12μl的 7G1-1*ascit e 液体( 5mg/ml )。 4°C下旋转试管 4 小时,1× PXL 洗三次; 如果你不准备加入交联裂解液, 在最后一步移去小珠 leave beads in last wash step 。 c. RL3 (-P) 接头(不含 P 磷)对 5’末端的标记。(在做IP 之前或过程中制备5’末端标记的接头。用预标记的3’接头做 AGO HITS-CLIP , 发现在放射自显影图中比免疫沉淀后 PNK 反应标记分离得到的 RNA 有更多特异性信号。) 2.4 μl RL3(-P) 接头(50pmol/ μl;5’端不含磷酸) 5μl 10× PNK Buff er (NEB) 25μl 32 P-γ-ATP 8μl T4 PNK enzyme(来源:淘豆网[http://www.taodocs.com/p-70193989.html]) (NEB, M0201L) 3μl RNA 酶(Promega) 6.6 μl water 50μl total 37°C 时用 Thermomixer R (Eppendorf) 孵育 30min 。加入 0.2 μl的 10mM 的 ATP ,继续反应 5min 。旋转使树脂重悬在 G-25 柱子中。事先以 735g 离心柱子 1min ,使样品混入树脂, 735g 旋转柱子 2min 。如果不打算立即使用,可以置于-20 °C 保存。 d. RNA 的部分消化以及超速离心用 700 μl1× PXL ( 含蛋白酶抑制剂; 总体积为 1ml ) 重悬每管的交联裂解液; 加入 15μl 的 RNA 酶(Promega) ,置于冰上 10min 。每管加入 30μl的 RQ1 DNA 酶, 37°C 孵育 5min 1000rpm 。在1× PXL 中以 1:100 稀释 RNA 酶(高浓度 RNA 酶) 在1× PXL 中以 1:1000 稀释 RNA 酶(低浓度 RNA 酶) 往两只试(来源:淘豆网[http://www.taodocs.com/p-70193989.html])管中分别加入两种浓度的 RNA 酶 10μl; 37°C 孵育 5min 。 30K for 20 min at4°C 超速微量离心(polycarbonate tubes in TLA 120.2 rotor) 裂解液。小心去上清,留下 10μl做 immunoblot 实验。 e. 免疫沉淀把剩余的上清加入另一只新的含有 bead 的试管中。4°C 旋转 beads/ 裂解液混合物 2-4 小时。去上清,留下 10μl做 immunoblot 实验( 以确定抗原被除尽)。用冰的缓冲液洗 beads : 2x 1X PXL (Wash Buffer) 2x 5X PXL (High-salt Wash Buffer ) 2x 1X PNK Buffer 【首次做 CLIP 实验对象应该是特殊的蛋白, 可以跳过 III -IV步, 直接进行第 V步。继续实验直到膜暴露在 X- 射线胶片上,检查以下问题是否存在: 1. 在高 RNA 酶的实验中,蛋白的 MW 上是否有 7kDa 的放射性条带?(来源:淘豆网[http://www.taodocs.com/p-70193989.html]) 2. 对照实验的条带是否不存在?对照组没有 UV 交联,含不相关的抗体,组织敲除, RNAi ,或者没有转染标记的结构。 3. 在低 RNA 酶实验中, 这条带是否向上移动并且更加扩散?如果是,对 RNA 结合蛋白进行处理,可以在接下来的实验中继续步骤 III。】【对含有低 RNA 酶( 1:300,000 )的样品继续步骤 III 。过渡消化的样品需要跳过 III -IV 步, 保存在 4°C 直到步骤 V。】 III . CIP 处理( on-bead ) 8μl 10× 去磷酸化脱磷酸缓冲液(Roche, 712023) 3μl 碱性磷酸酶(Roche, 712023) 2μl RNA 酶(Promega) 67μl水 80μl 总体积 37°C在 Thermomixer R (Eppendorf) 中孵育 20min (每两分钟 1000rpm 离心 内容来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.