斑马鱼的培养及TALENs技术的应用.docx

1 “斑马鱼的培养及 TALENs 技术的应用”预****报告一、实验原理 1、 TALENs 实验技术原理类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN) 是最近发展起来的一类新型的人工核酸内切酶, 它由特异性的 TALE DNA 结合结构域和非特异性的 Fok Ⅰ核酸内切酶切割结构域组成。 TALEN 能够根据用户需要切割特定的核苷酸靶序列, 造成 DNA 双链断裂, 从而诱导该靶序列产生 indel 突变。 2 、斑马鱼的生活****性以及作为模式生物的优势斑马鱼是生长在印度、巴基斯坦淡水河流中的一种硬骨鱼( 鲤鱼), 成年鱼全身仅长 4-5 厘米, 因全身横向分布着一道一道褐色的斑马线而得名。斑马鱼很容易在实验室饲养,一般 3 个月就可以达到生殖成熟期, 雌鱼每次产卵 200 枚左右, 一生可产卵数千枚, 斑马鱼所产之卵经 24 小时即可胚胎发育成熟, 仔鱼期只有 1 个月。更独特的是, 斑马鱼的卵是透明的, 整个胚胎发育在体外完成,也是透明的。优势: 显著优势在于体积小( 3cm ~4 cm) , 可在较小的空间大量繁殖; 产卵量高( 每周 200 多个) ;发育快,许多组织在受精后 24h 开始形成;成熟周期短;体外受精且胚胎透明,可在体视解剖镜下观察; 单倍体、雌核发育二倍体的制作和突变体的获得均较容易; 精子可以冷冻保存。所有这些特点都使斑马鱼非常适合于遗传学的研究。斑马鱼的基因组中大约含有 30000 个基因,这个数目与人类差不多,而且它的许多基因与人类存在一一对应的关系。它的神经中枢系统、内脏器官、血液以及视觉系统,在分子水平上 85% 与人相同。二、实验目的通过本实验可以了解 TALENs 实验技术的基本原理,熟悉其几个关键实验步骤的操作, 学****显微注射技术, 从而能够独立应用这些技术进行相关学术研究。三、实验器材 1 、实验仪器超净工作台( 细菌操作用) 、细菌培养摇床、台式离心机、凝胶电泳仪、凝胶电泳槽、凝胶成像仪、水浴锅、恒温培养箱、漩涡振荡器(Vortex) 、 NanoDrop(ND-1000 Spectro pho tometer) 、 PCR 仪,体视显微镜、恒温培养箱、配鱼缸、台式冷冻离心机 耗材细菌培养皿、移液枪、移液枪枪头、 Eppendorf 离心管、 PCR 管、显微操作仪,倒置显微镜, 拉针仪,胶头滴管,胶固定板。 2 、实验试剂 NEB 限制性内切酶: BstNI -HF 、 Kpn Ⅰ、 Nhe Ⅰ-HF 、 Not Ⅰ-HF 或 Sac Ⅱ、 Spe Ⅰ-HF 。试剂盒: DNA 连接试剂盒(TaKaRa, D6020) 、微量琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、质粒小提试剂 2 盒、快速 DNA 产物纯化试剂盒、 SP6mMESSAGE mMACHINE Kit(Ambion, AM1340)( 用于体外转录 TALEN mRNA) 、T 载体试剂盒(pMD ? 18-T,TaKaRa, D101A) 琼脂糖、 DNA marker 、1× TAE 、氨苄青霉素、 LB 琼脂培养基、 LB 液体培养基、 2× Taq MasterMix ( 含染料) 、碱性磷酸酶(CIAP, TaKaRa, D2250) 、1