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生物电子显微技术第八章电镜冷冻制样技术生物电子显微技术第一节冷冻制样的基础知识一金属投影技术二复型技术三电镜冷冻制样技术概述生物电子显微技术(一)发展概况: 1946,Willams 建立金属投影技术,主要用于观察颗粒材料,如病毒、细菌、原生动物、孢子、分离的微纤丝、蛋白质分子、核酸分子,以及其它非生物材料的微粒和粉末材料。 1955 , Hall,Huxley 提出负染色技术; 1959, Horne 和 Brenner 正式命名: Negative staining ,取代了金属投影技术。一金属投影技术生物电子显微技术目前金属投影技术主要用于:观察不适合负染色但需要金属投影来提高反差的样品;可用于测量颗粒的大小、高度,增加颗粒的尺寸,以改善粒子在 TEM 的可见性;是复型技术、冷冻断裂蚀刻复型技术的基础。生物电子显微技术 1. 金属投影技术的概念: 把具有高电子密度的金属材料( Pt, Pd,Au,Cu,Al), 加热到其熔点之上,以一定的角度沉积在样品表面形成投影,从而增加样品的反差,并使图像具有立体感。(二)、金属投影基本概念及原理: 生物电子显微技术生物电子显微技术⑴基本过程:真空蒸发→真空镀膜⑵基本原理: ?有金属沉积的部位散射能力强, TEM 像呈现暗区?无金属沉积的部位散射能力弱, TEM 像呈现亮区⑶基本特点: ?图像反差明显,富有强烈的立体感?样品被“包埋”在金属膜中,即样品表面被金属粒子覆盖,其图像分辨率由金属粒子大小限制,样品表面细微机构看不清,只能看到表面形貌。?不能分辨杂质和病毒,造成鉴定上的困难,故对病毒样品的纯度要求较高 : 生物电子显微技术真空镀膜仪: 10 -4~10 -5 Torr ⑴仪器结构真空钟罩:玻璃或金属钟罩; 两组电极(碳电极、金属电极);样品台。真空系统:两级泵真空系统, 10 -4~10 -5 Torr 加热电流供给系统:大电流变压器,提高 40- 50A 电流。⑵真空的作用: 防止样品受到热传导和对流引起的热损伤。防止样品受到金属氧化而引起的污染。 3. 所用仪器生物电子显微技术生物电子显微技术⑴.具有高电子密度,和较高的电子散射能力⑵.在喷镀层中金属颗粒细小,分布均匀, 高温下不升华,经久耐用⑶.在电子束作用下,金属不会粒状化⑷.化学稳定,不与样品反应⑸.熔点低,易于蒸发 4. 选用金属的标准