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RT-PCR 技术 RT-PCR 简介 RT-PCR 的指数扩增是一种很灵敏的技术,可以检测很低拷贝数的 RNA 。 RT-PCR 广泛应用于遗传病的诊断, 并且可以用于定量监测某种 RNA 的含量。(检测基因表达的方法,参见 Northern Blot 法。) RT-PCR 有时候也会指代实时 PCR(real-time PCR) 。为了与逆转录 PCR 相区别,通常被写作“定量 PCR ”(quantitative PCR) 或者 RTQ-PCR(real-time quantitative PCR) 。实时 PCR 实时 PCR(real-time PCR) ,属于定量 PCR ( Q-PCR )的一种,以一定时间内 DNA 的增幅量为基础进行 DNA 的定量分析。 real time PCR 的定量使用萤光色素, 目前有二种方法。一种是在 ds DNA (双链 DNA ) 中插入特异的萤光色素; 另一种使用一种能与增幅 DNA 序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针( probe )。 real time PCR 与 reverse transcription PCR( 反转录 PCR ) ) 相结合, 能用微量的 RNA 来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种 RT PCR 的组合又被称之为“定量 RT-PCR ( quantitative RT-PCR )” RT-PCR 技术相关试剂 oligo: 多聚体,相当于 mRNA 引物 AMV ( M-MLV ):逆转录酶 dNTP :脱氧核苷酸 RNase : RNA 酶抑制剂 PCR Buffer : RT-PCR 缓冲液 MgCl2 :2 价镁离子 PCR 各步骤的目的(一)预变性: 破坏 DNA 中可能存在的较难破坏的二级结构。使 DNA 充分变性,减少 DNA 复杂结构对扩增的影响,以利于引物更好的和模板结合,特别是对于基因组来源的 DNA 模板,最好不要吝啬这个步骤。此外,在一些使用热启动 Taq 酶的反应中,还可激活 Taq 酶,从而使 PCR 反应得以顺利进行。(二)变性-- 退火-- 延伸循环: ①模板 DNA 的变性:模板 DNA 经加热至 93℃左右一定时间后,使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离, 使之成为单链, 以便它与引物结合,为下轮反应作准备; ②模板 DNA 与引物的退火( 复性) :模板 DNA 经加热变性成单链后,温度降至 55℃左右,引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合; ③引物的延伸: DNA 模板-- 引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下, 以 dNTP 为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。(三) PCR 仪扩增循环后 72 度延伸 10 分钟用 PCR 仪扩增时,( 变性. 退火, 延伸) 循环完成后, 继续 72 度延伸了 10 分钟的原因: 1. 延伸时间取决于待扩增 DNA 片段的长度。(当然是在反应体系一定的条件下) 例如, 使用 taqDNA 聚合酶, 72 度时的碱基掺入率为 35-100bp/s , 因此延伸速率为 1kb/min 。 2. 根据延伸速率推得,扩增 1kb 以内的 dna 片段 1min 即可,而 3-4k b 则需要 3-4min ,依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至 4-10min ,这样做是使 pcr 反应完全以提高扩增产量。 3. 继续 72 度延伸了 10 分钟除了可以使 pcr 反应完全以提高扩增产量外,还有一个作用是:在用普通 taq 酶进行 PCR 扩增时在产物末端加 A尾的作用,可以直接用于 TA 克隆的进行。 RT-PCR 的注意事项在做 Northern 等杂交实验、构建 Cdna (互补 DNA )文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、获得 RNA 病毒基因时,会用到 RNA 提取和 RT-PCR 技术。真核生物的基因组是 DNA ,为什么不直接从 DNA PCR 得到我们需要的基因呢?因为真核生物的基因含有大量的非编码区,称为内元( intron ),真正编码蛋白的区段是被这些内元隔开的,这些编码区叫做外元( exon )。真核生物的 DNA 转录成为 RNA 之后,经过剪切和拼接,去掉这些非编码区,才形成成熟的 mRNA ,由 mRNA 再翻译成蛋白质。所以,如果直接从真核生物的基因组 DNA 获取目的基因,克隆再表达,试图获取目的蛋白的思路是行不通的,因为获取的 DNA 里面会含有非编码区。要表达真核生物的基因并表达出相应的蛋白, 只能通过提取其 mRNA 并 RT-PC R 这条颇费周折的途径。 1. RNA 的提取 RNA 的