伤科接骨片对家兔骨折模型肾组织转化生长因子β1表达的影响.doc

1 伤科接骨片对家兔骨折模型肾组织转化生长因子拟β1 表达的影响作者: 张继平张奋耿宫丽姚晖邱建文林爱华许碧莲吴铁【摘要】【目的】观察伤科接骨片对模型家兔骨折愈合过程中肾组织转化生长因子拟β1( TGF 拟β1 )表达变化的影响。【方法】选用 36 只雄性新西兰家兔, 均复制成单侧桡骨中上 1/3 标准骨折模型;随机分为模型对照组和伤科接骨片组,每组 18 只,每组再分 3 个亚组,每个亚组 6 只。术后第 2 天开始给药, 于术后第 11、 21和 35 天分别处死各亚组动物, 取肾脏, 采用免疫组化染色, 应用图像分析的方法测定肾组织 TGF 拟β1 表达含量。【结果】第 11 天和第 21 天时伤科接骨片组肾组织 TGF 拟β1 的表达水平均较模型对照组显著提高( P<0 . 05或P<0 . 01 );第35 天时伤科接骨片组与模型对照组比较差异无显著性意义(P >0 . 05 )。【结论】伤科接骨片促进骨折愈合的作用可能与其调节肾组织 TGF 拟β1 表达水平有关。 2 【关键词】伤科接骨片/药理学骨折/中药疗法肾组织/病理学疾病模型动物兔伤科接骨片是目前广泛应用于骨伤科临床的中成药, 具有活血化瘀、消肿止痛、续筋接骨、补肾壮骨等功能。临床及实验研究已从组织学、组织形态学、生物力学等不同角度证实该药能够促进骨折愈合[1-2]。研究表明伤科接骨片可调节骨折模型家兔愈合过程中骨痂中转化生长因子拟β( TGF 拟β1) 的合成和分泌, 其作用在骨折的早、中期明显[3]。 TGF 拟β是一族具有多种功能的蛋白多肽, 在骨形成和重建过程中协调间充质细胞、成骨细胞和破骨细胞的活动, 对骨修复发挥重要作用[4]。骨是体内 TGF 拟β最丰富的来源, TGF 拟β1 在骨基质中的含量约占 TGF 拟β总量的 80 %~ 90%, 体内几乎所有细胞均可合成 TGF 拟β1 并表达相关受体, 因此在调节骨折愈合过程中, TGF 拟β1 发挥的作用最为重要[5]。本研究观察了伤科接骨片对模型家兔骨折愈合过程中兔肾组织中 TGF 拟β1 表达含量的影响,现报道如下。 1 材料与方法 动物 5~8 月龄雄性新西兰家兔 36 只,体质量( ± ) kg [合格证号:粤监证字 2006A006SYXK (粤) 3 2003 拟 0001 ,动物环境设施合格证号: SYXK (粤) 2003 拟 0001 ] ,由广州中医药大学实验动物中心提供。 药物、试剂与仪器伤科接骨片由大连美罗中药厂生产( 批号: 200505209 ); TGF 拟β1 免疫组织化学试剂盒(武汉博士德生物工程公司); HPIAS 拟 2000 多媒体彩色病理图像分析系统(同济千屏影像公司生产); 941395 型显微镜( Olympus Japan )。 骨折模型复制[6]用 30g/L 戊巴比妥钠( 1mL/kg ) 经耳缘静脉麻醉, 剪毛后常规消毒铺巾, 切开皮肤, 分离组织,暴露桡骨,用牙科电钻在右侧桡骨中、上段 1/3 交界处(即旋前圆肌止点附近)横行锯断一侧骨皮质,造成 3m m 宽的骨缺损, 保留尺骨完整。逐层缝合, 包扎伤口, 但不固定。骨折术后即肌肉注射青霉素( 4× 105U/ 只) , 每日 1 次, 共 3d, 5d 后拆除皮肤缝线。 分组及给药 36 只造模成功的骨折家兔随机分为模型对照组和伤科接骨片组,每组 18 只。每组再分 3 个亚组(分别于术后 11、 21、 35d 处死) ,每个亚组 6 只。动物单笼饲养, 术后第 2 天开始给药, 伤科接骨片组给予含伤科接骨片的饲料(按 150mg · kg-1 · d-1 的药量将药片加入标准颗粒 4 饲料中制成含药饲料) 120g , 模型对照组给予标准颗粒饲料 120g ,每天 1 次,直至处死。 肾组织标本留取家兔分别于术后第 11、 21、 35天以戊巴比妥钠麻醉后心脏放血处死, 腹正中切口取肾脏去包膜,置入 Bouin 液中固定。 免疫组织化学染色肾组织固定后,经常规酒精脱水, 石蜡包埋, 制成 4μm 切片, 37℃恒温箱过夜; 采用链霉亲和素- 生物素复合物法( SABC 法) 检测 TGF 拟β1, 切片脱蜡至水, 依次经体积分数 % H2O2 室温 15min , 复合消化液室温 10min ,正常血清封闭液 37℃、 30min ,兔抗 TGF 拟β1 多克隆抗体( 1: 150 )4℃过夜;生物素化羊抗兔 IgG 37 ℃、 30min , SABC 试剂 37℃、 30min ;3砼3 拟二氨基联苯***( DAB )显色,苏木精对比染色;脱水、透明、封片; 用磷酸盐缓冲液( PBS )代替一抗作为阴性对照,用