低分子姬松茸多糖对Bel-7402细胞端粒酶-RNA mRNA表达的影响.doc

1 低分子姬松茸多糖对 Bel-7402 细胞端粒酶-RNA mRNA 表达的影响作者:牛英才赵学梅张春林春荣李雪岩刘吉成【摘要】目的探讨低分子姬松茸多糖(a low molecular wEight haride isolated from Agaricus blazEI, LMPAB) 对人肝癌细胞 Bel-7402 端粒酶-RNA mRNA 表达的影响。方法5, 10和 20μg· ml-1 浓度的 LMPAB 处理体外培养的 Bel-7402 细胞 48h 后,采用原位杂交法检测端粒酶-RNA mRNA 表达。结果 LMPAB 下调体外培养 Bel-7402 端粒酶-RNA mRNA 的表达,呈剂量依赖性。与空白对照组比较, 端粒酶-RNA mRNA 的表达差异具有统计学意义(P< )。结论 LMPAB 具有下调端粒酶-RNA mRNA 表达的作用,进而降低端粒酶活性,抑制肿瘤细胞生长。【关键词】低分子姬松茸多糖抗肿瘤端粒酶端粒酶是目前所发现的恶性肿瘤最为广谱的分子标记,在绝大多数恶性肿瘤中阳性表达, 而在造血细胞和胚胎肝细胞 2 以外的正常组织细胞内为阴性表达, 端粒酶活性是恶性肿瘤发生重要标志之一[1]。肿瘤细胞经化疗杀伤或诱导分化后端粒酶活性显著降低,提示针对端粒酶活性的药物可能为治疗肿瘤提供新的途径[ 2] ,端粒酶可作为抗肿瘤治疗的一个新靶点。多糖是由单糖连接而成的生物大分子物质,多糖的糖链能控制细胞的增殖和分化,调节细胞的生长与衰老, 在抗肿瘤和促进免疫力方面疗效明确, 毒副作用小[3]。近年来,多糖的抗肿瘤活性研究受到越来越广泛的关注。本研究采用原位杂交法,观察低分子姬松茸多糖( a low molecular weight haride isolated from Agaricus blazei, LMPAB )对 Bel-7402 细胞端粒酶-RNA mRNA 表达的影响, 探讨 LMPAB 抗肿瘤的机制。 1 器材与方法 材料 药物 LMPAB 由齐齐哈尔医学院医药科学研究所分离提取[4]; 猪苓多糖注射液购自江苏省正大天晴药业股份有限公司;姬松茸粗多糖购自浙江庆元博瑞药业有限公司。 3 细胞 Bel-7402 细胞株购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 试剂与仪器 DAB kit/DAB 试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司); RNase-free H2O ( 宝生物工程有限公司); RPMI-1640 MEDIUM cell culture reagents ( Hyclone ); Trypsin % Solution ( Hyclone 公司)。 PM-20 型全自动显微摄影仪(日本 OLYMPUS ); COI C 型倒置显微镜( 重庆光学仪器厂); Motic Med 数码医学图像分析系统( 北京麦克奥迪图像技术有限公司)。 SuperFrost 飡 Plus 原位杂交专用载玻片(美国 Erie 科技公司); 原位杂交专用盖玻片( 武汉博士德生物工程有限公司)。 杂交探针序列端粒酶-RNA :①5’-TAGGC GCCGT GCTTT CGC GCGCT-3 ’;②5’-AAAAT GTCAG CTGCT CCT-3 ’;③5’-TGA GCTGT GGGAC CAG-3 ’。 方法 细胞培养从液氮罐中取出保存 Bel-7402 冻存管,迅速放置 37℃温水中轻轻摇动, 使其尽快融化。在超净工作台 4 内用酒精消毒冻存管后, 用吸管吸出细胞悬液, 注入离心管, 并加 10 倍培养液,混合后低速离心,除去上清液,重复洗涤细胞 1 次。分别加入 5 ml DMEM 培养液,吹散细胞,将细胞悬液吸至培养瓶中, 放入 37℃、 5% CO2 浓度的培养箱中培养过夜。次日, 观察细胞生长贴壁情况, 更换新鲜培养液, 继续培养。待细胞生长到覆盖 80% 瓶底壁时, 准备传代。倒掉瓶内旧培养液,加适量 % 胰酶,使消化液流遍所有细胞, 37℃消化细胞约 5 min ,显微镜下观察细胞变形,加入含血清的培养液终止消化, 并用吸管轻轻反复吹打贴壁的细胞, 使细胞完全脱落。将细胞悬液移入离心管,1 500 r/mi n 离心 5 min ,弃上液,加入适量 DMEM 培养液吹散细胞。取适量细胞悬液在显微镜下用细胞计数板计数, 然后按一定细胞数量分别接种于新的培养瓶中, 放入 37℃、 5% CO2 浓度的培养箱中培养。论文联盟。 细胞爬片的制备当 Bel-7402 细胞处于对数生长期,倒掉培养瓶内旧培养液,加适量 % 胰酶, 37℃消化约5 min 。显微镜下观察,细胞脱落变