低分子肝素抗肝癌细胞增殖及机制研究.doc

1 低分子肝素抗肝癌细胞增殖及机制研究论文联盟 。作者: 陈公英李敏伟陈智顾新宇周慧明【摘要】[目的] 研究低分子肝素( LMWH )抗肝癌细胞 SMMC-7721 增殖作用及机制。[ 方法] MTT 法测 LMWH 、 UFH 及联合化疗药物阿霉素(ADR) 对 SMMC-7721 的生长抑制作用,流式细胞仪 Annexin V FITC-PI 法检测细胞凋亡发生率, 同时 Western blot 检测细胞 p53 、 bcl-2 蛋白表达。[ 结果] LMWH 、 UFH 能抑制细胞生长,呈剂量依赖关系,并与诱导细胞凋亡有关;化疗药物 ADR 联合肝素有协同抗增殖作用。 LMWH 、 UFH 促进细胞凋亡过程中, p53 表达无明显改变, bcl-2 表达略下调。[结论] 肝素、低分子肝素可通过诱导细胞凋亡发挥抗肝癌作用;化疗药物 ADR 联合肝素有协同抗增殖作用。【关键词】低分子肝素流式细胞术凋亡阿霉素肝癌细胞 2 肝素(高硫酸化葡萄***聚糖)是一种重要的抗凝药物。除了抗凝活性以外,近来发现其具有抗肿瘤、抗炎症、抗病毒等生物学作用, 特别是抗肿瘤作用更受学者关注。近年发展起来的一种生化药物低分子量肝素,减少了由完整肝素带来的出血和血小板减少等副作用[1] , 因而用于治疗某些恶性肿瘤效果好且安全。本文主要研究低分子肝素抗肝癌细胞 SMMC? 鄄 7721 的增殖作用及机制。 1 材料与方法 材料肝素钠注射液, 12 500U/2ml ( 南京新天生物有限公司);低分子量肝素钠,4 250IU/ ( 意大利 ALFA WASSERMANN 大药厂); MTT ( Sigma 公司) ; ANNEXIN V? 鄄PI 检测试剂盒( 美国 CALTAG 公司); 鼠抗人 p53 、 bcl? 鄄2单克隆抗体( DAKO 公司); biotinylated protEin ladder detection pack(cell signaling 公司) ;肝癌细胞株 SMMC? 鄄 7721 购于中科院上海细胞生物所。主要仪器:免疫学标本制备仪( EPICS? 鄄 Q? 鄄 PREP 型,美国 Coulter 公司产品) ,流式细胞仪( EPICS? 鄄 XL 型,美国 Coulter 公司产品)。 3 方法 细胞培养肝癌细胞株 SMMC? 鄄 7721 采用含 10% ( V/V ) 的小牛血清、 300 μ g/ml L? 鄄谷氨酰***、 100IU/ml 青霉素和 25μ g/ml 链霉素的 RPIM1640 ( GIBCO BL ) 培养基、在 37℃、 5%CO2 及饱和湿度的条件下培养。 细胞增殖抑制试验按文献方法[1] 将对数生长期细胞按 2× 104 ( 100 μl)/孔接种于 96 孔板,用含 10% 的小牛血清的培养基 100 μl培养 24h ,去掉培养基,加入用完全培养基配制的不同浓度两种肝素(0~ 100U/ml ), 并选择合适剂量 25U/ml 、 50U/ml 肝素加入亚毒性剂量的阿霉素,用完全培养基加至 100 μl ;同时设空白对照, 每个浓度均设 3 个复孔。培养 48h 后, 每孔加入 20μ l(5mg/ml)MTT , 孵育 4h。倾去上清液, 加入二甲亚砜 150 μ l/ 孔,于酶标仪上读取 A570nm 值, 计算细胞生长抑制率=[( 1- 实验组吸光值/ 对照组吸光值)]× 100% , 得出量效关系曲线。 4 凋亡检测将细胞以 105/ml 接种于 24 孔。用含有 10% 的小牛血清的培养基 1ml 培养 24h 后倾去培养液, 加入含合适剂量肝素的完全培养基 1ml ,培养 48h, 以不用肝素处理的细胞作阴性对照。采用流式细胞术检测 Annexin V 和碘化丙啶( PI )荧光标记细胞凋亡值。操作严格按试剂盒说明书进行。结果以 Annexin V 染色阳性, PI 染色阴性判定。 Western blot 分析采用细胞裂解缓冲液(25mmol/L Hepes , %Triton X? 鄄 100 , 1% 去氧胆酸钠, %SDS , NaCl , 5mmol/L EDTA , 50mmol/L NaF , 1mmol/L PMSF , Leupeptin) () 4℃ 30min 裂解细胞。 15 000g 离心 15min ,取上清液。用 Bradford 法进行蛋白定量。加上样缓冲液(42mmol/L Tris? 鄄 HCl , 10% 甘油, % SDS , 5% 2? 鄄巯基乙醇、 % 溴芬蓝)煮沸 3m